Kompyuter tomografiyasi (KT) yordamida aniqlangan o'pka tugunlarini differentsial tashxislash klinik amaliyotda qiyinchilik tug'dirmoqda. Bu yerda biz sog'lom nazorat guruhi, benign o'pka tugunlari va I bosqich o'pka adenokarsinomasini o'z ichiga olgan 480 ta zardob namunalarining global metabolomini tavsiflaymiz. Adenokarsinomalar noyob metabolomik profillarni namoyish etadi, benign tugunlar va sog'lom shaxslar metabolomik profillarda yuqori o'xshashlikka ega. Kashfiyot guruhida (n = 306) benign va malign tugunlarni farqlash uchun 27 ta metabolitlar to'plami aniqlandi. Ichki validatsiya (n = 104) va tashqi validatsiya (n = 111) guruhlaridagi diskriminant modelning AUC mos ravishda 0,915 va 0,945 ni tashkil etdi. Yo'l tahlili benign tugunlar va sog'lom nazorat guruhiga nisbatan o'pka adenokarsinomasi zardobida triptofanning kamayishi bilan bog'liq glikolitik metabolitlarning ko'payganligini aniqladi va triptofanning qabul qilinishi o'pka saraton hujayralarida glikolizni kuchaytirishini ko'rsatdi. Bizning tadqiqotimiz KT orqali aniqlangan o'pka tugunlari xavfini baholashda sarum metabolitlari biomarkerlarining ahamiyatini ta'kidlaydi.
Saraton kasalligi bilan og'rigan bemorlarning omon qolish darajasini oshirish uchun erta tashxis qo'yish juda muhimdir. AQSh Milliy o'pka saratonini skrining qilish sinovi (NLST) va Yevropa NELSON tadqiqoti natijalari shuni ko'rsatdiki, past dozali kompyuter tomografiyasi (LDCT) bilan skrining yuqori xavf guruhlarida o'pka saratonidan o'limni sezilarli darajada kamaytirishi mumkin1,2,3. O'pka saratonini skrining qilish uchun LDCT keng qo'llanilganidan beri, asemptomatik o'pka tugunlarining tasodifiy rentgenologik topilmalari soni ortib bormoqda4. O'pka tugunlari diametri 3 sm gacha bo'lgan fokal xiralik sifatida belgilanadi5. Biz xavfli o'sma ehtimolini baholashda va LDCTda tasodifan aniqlangan ko'p sonli o'pka tugunlari bilan kurashishda qiyinchiliklarga duch kelmoqdamiz. KTning cheklanganligi tez-tez kuzatuv tekshiruvlariga va noto'g'ri ijobiy natijalarga olib kelishi mumkin, bu esa keraksiz aralashuv va haddan tashqari davolanishga olib keladi6. Shuning uchun o'pka saratonini dastlabki bosqichlarda to'g'ri aniqlash va dastlabki aniqlashda ko'pgina benign tugunlarni farqlash uchun ishonchli va foydali biomarkerlarni ishlab chiqish zarurati mavjud7.
Qonning (zardob, plazma, periferik qon mononuklear hujayralari) keng qamrovli molekulyar tahlili, jumladan, genomika, proteomika yoki DNK metilatsiyasi8,9,10, o'pka saratoni uchun diagnostik biomarkerlarni kashf etishga qiziqishning ortishiga olib keldi. Shu bilan birga, metabolomika yondashuvlari endogen va ekzogen ta'sirlar ta'sirida bo'lgan hujayrali oxirgi mahsulotlarni o'lchaydi va shuning uchun kasallikning boshlanishi va natijasini bashorat qilish uchun qo'llaniladi. Suyuq xromatografiya-tandem massa spektrometriyasi (LC-MS) yuqori sezgirligi va katta dinamik diapazoni tufayli metabolomika tadqiqotlari uchun keng qo'llaniladigan usul bo'lib, u turli fizik-kimyoviy xususiyatlarga ega metabolitlarni qamrab olishi mumkin11,12,13. Plazma/zardobning global metabolomik tahlili o'pka saratoni tashxisi bilan bog'liq biomarkerlarni aniqlash uchun ishlatilgan bo'lsa-da14,15,16,17 va davolash samaradorligi,18 zararli va xavfli o'pka tugunlarini farqlash uchun sarum metabolitlari tasniflagichlari hali ham ko'p o'rganilishi kerak. - katta tadqiqotlar.
Adenokarsinoma va skuamoz hujayrali karsinoma kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratonining (NSCLC) ikkita asosiy turi hisoblanadi. Turli KT skrining testlari adenokarsinoma o'pka saratonining eng keng tarqalgan gistologik turi ekanligini ko'rsatadi1,19,20,21. Ushbu tadqiqotda biz sog'lom nazorat guruhi, benign o'pka tugunlari va KT orqali aniqlangan ≤3 sm ni o'z ichiga olgan jami 695 ta zardob namunalarida metabolomika tahlilini o'tkazish uchun ultra samarali suyuqlik xromatografiyasi-yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) dan foydalandik. I bosqich o'pka adenokarsinomasini skrining qilish. Biz o'pka adenokarsinomasini benign tugunlar va sog'lom nazorat guruhidan ajratib turadigan zardob metabolitlari panelini aniqladik. Yo'lni boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, triptofan va glyukoza metabolizmining g'ayritabiiyligi benign tugunlar va sog'lom nazorat guruhiga nisbatan o'pka adenokarsinomasida keng tarqalgan o'zgarishlar hisoblanadi. Nihoyat, biz LDCT tomonidan aniqlangan xavfli va xavfsiz o'pka tugunlarini farqlash uchun yuqori o'ziga xoslik va sezgirlikka ega bo'lgan zardob metabolik klassifikatorini yaratdik va tasdiqladik, bu esa erta differentsial tashxis qo'yish va xavfni baholashga yordam berishi mumkin.
Joriy tadqiqotda jinsi va yoshiga mos keladigan zardob namunalari 174 ta sog'lom nazorat guruhidan, o'pkaning benign tugunlari bo'lgan 292 bemordan va o'pka adenokarsinomasining I bosqichidagi 229 bemordan retrospektiv ravishda to'plandi. 695 ta sub'ektning demografik xususiyatlari 1-qo'shimcha jadvalda keltirilgan.
1a-rasmda ko'rsatilganidek, Sun Yat-sen universiteti saraton markazida jami 480 ta zardob namunalari, jumladan, 174 ta sog'lom nazorat guruhi (HC), 170 ta benign tugunlar (BN) va 136 ta I bosqich o'pka adenokarsinomasi (LA) namunalari to'plandi. Ultra samarali suyuqlik xromatografiyasi-yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) yordamida maqsadsiz metabolomik profil yaratish uchun kashfiyot kohortasi. 1-qo'shimcha rasmda ko'rsatilganidek, tasniflash modelini yaratish va differentsial yo'l tahlilini yanada o'rganish uchun LA va HC, LA va BN o'rtasidagi differentsial metabolitlar aniqlandi. Sun Yat-sen universiteti saraton markazi tomonidan to'plangan 104 ta namuna va boshqa ikkita kasalxona tomonidan to'plangan 111 ta namuna mos ravishda ichki va tashqi validatsiyadan o'tkazildi.
a Kashfiyot kohortasidagi tadqiqot populyatsiyasi ultra-samarador suyuqlik xromatografiyasi-yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) yordamida global zardob metabolomikasi tahlilidan o'tkazildi. b Sog'lom nazorat guruhi (HC, n = 174), benign tugunlar (BN, n = 170) va I bosqich o'pka adenokarsinomasi (Los-Anjeles, n = 136) ni o'z ichiga olgan tadqiqot kohortasidan olingan 480 ta zardob namunalarining umumiy metabolomining qisman eng kichik kvadratlar diskriminant tahlili (PLS-DA). +ESI, musbat elektropurkash ionlanish rejimi, -ESI, manfiy elektropurkash ionlanish rejimi. c–e Vulqon grafikasida ko'rsatilgan ikkita berilgan guruhda (ikki dumli Uilkoxon imzoli daraja testi, noto'g'ri kashfiyot tezligi sozlangan p qiymati, FDR <0,05) sezilarli darajada farq qiluvchi metabolitlar qizil (katlama o'zgarishi > 1,2) va ko'k (katlama o'zgarishi <0,83) rangda ko'rsatilgan. ). f LA va BN o'rtasidagi izohlangan metabolitlar sonidagi sezilarli farqlarni ko'rsatadigan ierarxik klasterlash issiqlik xaritasi. Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlari fayllari ko'rinishida taqdim etiladi.
Kashfiyot guruhidagi 174 HC, 170 BN va 136 LA ning umumiy zardob metabolomi UPLC-HRMS tahlili yordamida tahlil qilindi. Avvalo, sifat nazorati (QC) namunalari nazoratsiz asosiy komponent tahlili (PCA) modelining markazida zich joylashganligini ko'rsatamiz, bu esa joriy tadqiqot samaradorligining barqarorligini tasdiqlaydi (2-qo'shimcha rasm).
1b-rasmdagi qisman eng kichik kvadratlar diskriminant tahlilida (PLS-DA) ko'rsatilgandek, biz musbat (+ESI) va manfiy (−ESI) elektropurkash ionlanish rejimlarida LA va BN, LA va HC o'rtasida aniq farqlar borligini aniqladik. Biroq, +ESI va -ESI sharoitlarida BN va HC o'rtasida sezilarli farqlar topilmadi.
Biz LA va HC o'rtasida 382 ta differentsial xususiyatni, LA va BN o'rtasida 231 ta differentsial xususiyatni va BN va HC o'rtasida 95 ta differentsial xususiyatni topdik (Wilcoxon imzolangan daraja testi, FDR <0.05 va ko'p o'zgarish >1.2 yoki <0.83) (.1c-e-rasm). . Cho'qqilar ma'lumotlar bazasiga (mzCloud/HMDB/Chemspider kutubxonasi) nisbatan m/z qiymati, saqlash vaqti va parchalanish massa spektrini qidirish (batafsil ma'lumotlar Metodlar bo'limida tasvirlangan) bo'yicha qo'shimcha ravishda izohlandi (Qo'shimcha ma'lumotlar 3). Nihoyat, mos ravishda LA va BN (1f-rasm va 2-qo'shimcha jadval) va LA va HC (3-qo'shimcha rasm va 2-qo'shimcha jadval) uchun mo'l-ko'llikda sezilarli farqlarga ega 33 va 38 ta izohlangan metabolitlar aniqlandi. Aksincha, BN va HC da mo'l-ko'llikda sezilarli farqlarga ega atigi 3 ta metabolit aniqlandi (2-qo'shimcha jadval), bu PLS-DA da BN va HC o'rtasidagi o'xshashlikka mos keladi. Bu differentsial metabolitlar turli xil biokimyoviy moddalarni qamrab oladi (4-qo'shimcha rasm). Birgalikda, bu natijalar sarum metabolomasida sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatadi, bu esa o'pka saratonining erta bosqichdagi xavfli transformatsiyasini benign o'pka tugunlari yoki sog'lom odamlarga nisbatan aks ettiradi. Shu bilan birga, BN va HC sarum metabolomining o'xshashligi benign o'pka tugunlari sog'lom odamlar bilan ko'plab biologik xususiyatlarga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Epidermal o'sish omili retseptorlari (EGFR) gen mutatsiyalari o'pka adenokarsinomasining 23-kichik turida keng tarqalganligini hisobga olib, biz drayver mutatsiyalarining sarum metabolomiga ta'sirini aniqlashga harakat qildik. Keyin biz o'pka adenokarsinomasi guruhidagi EGFR holatiga ega 72 ta holatning umumiy metabolomik profilini tahlil qildik. Qizig'i shundaki, biz PCA tahlilida EGFR mutant bemorlari (n = 41) va EGFR yovvoyi tipdagi bemorlar (n = 31) o'rtasida o'xshash profillarni topdik (5a-qo'shimcha rasm). Biroq, biz EGFR mutatsiyasiga ega bemorlarda yovvoyi tipdagi EGFRga ega bemorlarga nisbatan miqdori sezilarli darajada o'zgargan 7 ta metabolitni aniqladik (t testi, p < 0,05 va buklanish o'zgarishi > 1,2 yoki < 0,83) (Qo'shimcha 5b-rasm). Ushbu metabolitlarning aksariyati (7 tadan 5 tasi) yog 'kislotalarining oksidlanish yo'llarida muhim rol o'ynaydigan asilkarnitinlardir.
2a-rasmda ko'rsatilgan ish jarayonida ko'rsatilganidek, tugunlarni tasniflash uchun biomarkerlar eng kam absolyut qisqarish operatorlari va LA (n = 136) va BN (n = 170) da aniqlangan 33 ta differentsial metabolitlarga asoslangan tanlov yordamida olingan. O'zgaruvchilarning eng yaxshi kombinatsiyasi (LASSO) – ikkilik logistik regressiya modeli. Modelning ishonchliligini tekshirish uchun o'n barobar o'zaro tasdiqlash qo'llanildi. O'zgaruvchilarni tanlash va parametrlarni tartibga solish λ24 parametri bilan ehtimollikni maksimallashtirish jarimasi bilan sozlanadi. Diskriminant modelning tasniflash samaradorligini sinab ko'rish uchun global metabolomika tahlili ichki tasdiqlash (n = 104) va tashqi tasdiqlash (n = 111) guruhlarida mustaqil ravishda amalga oshirildi. Natijada, kashfiyot to'plamidagi 27 ta metabolit eng katta o'rtacha AUC qiymatiga ega eng yaxshi diskriminant model sifatida aniqlandi (2b-rasm), ulardan 9 tasi BN ga nisbatan LA da faollikni oshirgan va 18 tasi pasaygan (2c-rasm).
O'pka tugunlari klassifikatorini yaratish uchun ish jarayoni, shu jumladan o'n barobar o'zaro tekshirish orqali ikkilik logistik regressiya modelidan foydalangan holda kashfiyot to'plamidagi sarum metabolitlarining eng yaxshi panelini tanlash va ichki va tashqi tekshirish to'plamlarida bashoratli ishlashni baholash. b Metabolik biomarkerlarni tanlash uchun LASSO regressiya modelining o'zaro tekshirish statistikasi. Yuqorida keltirilgan raqamlar berilgan λ da tanlangan biomarkerlarning o'rtacha sonini ifodalaydi. Qizil nuqta chiziq mos keladigan lambdadagi o'rtacha AUC qiymatini ifodalaydi. Kulrang xato chiziqlari minimal va maksimal AUC qiymatlarini ifodalaydi. Nuqta chiziq 27 ta tanlangan biomarkerga ega eng yaxshi modelni ko'rsatadi. AUC, qabul qiluvchi operatsion xarakteristikasi (ROC) egri chizig'i ostidagi maydon. c LA guruhidagi 27 ta tanlangan metabolitlarning kashfiyot guruhidagi BN guruhi bilan solishtirganda katlama o'zgarishlari. Qizil ustun - faollashuv. Moviy ustun pasayishdir. d–f Kashfiyot, ichki va tashqi tekshirish to'plamlaridagi 27 ta metabolit kombinatsiyasiga asoslangan diskriminant modelning kuchini ko'rsatuvchi qabul qiluvchi operatsion xarakteristikasi (ROC) egri chiziqlari. Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlari fayllari ko'rinishida taqdim etiladi.
Ushbu 27 metabolitning og'irlikdagi regressiya koeffitsientlari asosida bashorat modeli yaratildi (3-qo'shimcha jadval). Ushbu 27 metabolitga asoslangan ROC tahlili egri chiziq ostidagi maydon (AUC) qiymati 0,933, kashfiyot guruhining sezgirligi 0,868 va o'ziga xoslik 0,859 ni ko'rsatdi (2d-rasm). Shu bilan birga, LA va HC o'rtasidagi 38 ta izohlangan differentsial metabolitlar orasida 16 ta metabolit to'plami LA ni HC dan ajratishda 0,801 sezgirlik va 0,856 o'ziga xoslik bilan 0,902 AUC ga erishdi (6a-c qo'shimcha rasm). Differentsial metabolitlar uchun turli xil buklanish o'zgarishi chegaralariga asoslangan AUC qiymatlari ham taqqoslandi. Biz tasniflash modeli buklanish o'zgarishi darajasi 1,2 ga nisbatan 1,5 yoki 2,0 ga o'rnatilganda LA va BN (HC) o'rtasidagi farqni aniqlashda eng yaxshi natija ko'rsatganini aniqladik (7a, b qo'shimcha rasm). 27 ta metabolit guruhiga asoslangan tasniflash modeli ichki va tashqi kohortalarda qo'shimcha ravishda tasdiqlandi. AUC ichki tasdiqlash uchun 0,915 (sezgirlik 0,867, o'ziga xoslik 0,811) va tashqi tasdiqlash uchun 0,945 (sezgirlik 0,810, o'ziga xoslik 0,979) ni tashkil etdi (2e, f-rasm). Laboratoriyalararo samaradorlikni baholash uchun tashqi kohortadan 40 ta namunalar "Usullar" bo'limida tasvirlanganidek, tashqi laboratoriyada tahlil qilindi. Tasniflash aniqligi 0,925 AUC ga erishdi (8-qo'shimcha rasm). O'pka skuamoz hujayrali karsinomasi (LUSC) o'pka adenokarsinomasidan (LUAD) keyin mayda hujayrali bo'lmagan o'pka saratonining (NSCLC) ikkinchi eng keng tarqalgan turi bo'lgani uchun, biz metabolik profillarning tasdiqlangan potentsial foydaliligini ham sinab ko'rdik. BN va LUSCning 16 ta holati. LUSC va BN o'rtasidagi farqlashning AUC qiymati 0,776 ni tashkil etdi (9-qo'shimcha rasm), bu LUAD va BN o'rtasidagi farqlash bilan solishtirganda qobiliyatning yomonroq ekanligini ko'rsatadi.
Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, KT tasvirlaridagi tugunlarning kattaligi xavfli o'sma ehtimoli bilan ijobiy bog'liq va tugunlarni davolashning asosiy omili bo'lib qolmoqda25,26,27. NELSON skrining tadqiqotining katta kohortasi ma'lumotlarini tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, tugunlari <5 mm bo'lgan sub'ektlarda xavfli o'sma xavfi hatto tugunlari bo'lmagan sub'ektlardagiga o'xshash edi28. Shuning uchun, muntazam KT monitoringini talab qiladigan minimal o'lcham Britaniya Torakal Jamiyati (BTS) tomonidan tavsiya etilganidek 5 mm va Fleischner Jamiyati tomonidan tavsiya etilganidek 6 mm29. Biroq, 6 mm dan katta va aniq benign xususiyatlarga ega bo'lmagan, noaniq o'pka tugunlari (IPN) deb ataladigan tugunlar klinik amaliyotda baholash va davolashda katta muammo bo'lib qolmoqda30,31. Keyin biz kashfiyot va ichki tasdiqlash kohortalaridan olingan birlashtirilgan namunalar yordamida tugun hajmi metabolik imzolarga ta'sir qilganmi yoki yo'qligini tekshirdik. 27 ta tasdiqlangan biomarkerga e'tibor qaratib, biz avval HC va BN sub-6 mm metabolomlarining PCA profillarini taqqosladik. Biz HC va BN uchun ma'lumotlar nuqtalarining aksariyati bir-biriga mos kelishini aniqladik, bu ikkala guruhda ham zardob metabolitlari darajasi o'xshashligini ko'rsatdi (3a-rasm). Turli o'lcham diapazonlaridagi xususiyat xaritalari BN va LA da saqlanib qolgan (3b-rasm, c), 6-20 mm oralig'ida esa xavfli va xavfsiz tugunlar o'rtasida farq kuzatilgan (3d-rasm). Ushbu kohorta 6 dan 20 mm gacha bo'lgan tugunlarning xavfliligini bashorat qilish uchun AUC 0,927, o'ziga xoslik 0,868 va sezgirlik 0,820 ga teng edi (3e-rasm, f). Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, klassifikator tugun hajmidan qat'i nazar, erta xavfli transformatsiya natijasida yuzaga kelgan metabolik o'zgarishlarni qayd eta oladi.
reklama 27 ta metabolitdan iborat metabolik klassifikator asosida belgilangan guruhlar orasidagi PCA profillarini taqqoslash. CC va BN < 6 mm. b BN < 6 mm va BN 6–20 mm. LA 6–20 mm da LA 20–30 mm ga nisbatan. g BN 6–20 mm va LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm tugunlar uchun diskriminant model ishlashini ko'rsatuvchi qabul qiluvchining ish xarakteristikasi (ROC) egri chizig'i. f Ehtimollik qiymatlari 6–20 mm o'lchamdagi tugunlar uchun logistik regressiya modeli asosida hisoblab chiqilgan. Kulrang nuqtali chiziq optimal kesish qiymatini (0,455) ifodalaydi. Yuqoridagi raqamlar Los-Anjeles uchun prognoz qilingan holatlar foizini ifodalaydi. Ikki tomonlama Student t testidan foydalaning. PCA, asosiy komponent tahlili. Egri chiziq ostidagi AUC maydoni. Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlar fayllari ko'rinishida taqdim etiladi.
Taklif qilingan xavfli o'smani bashorat qilish modelining ishlashini ko'rsatish uchun o'pka tugunlarining o'lchamlari (7-9 mm) o'xshash bo'lgan to'rtta namuna (44-61 yosh) tanlab olindi (4a-rasm, b). Dastlabki skriningda 1-holat kalsifikatsiyaga ega qattiq tugun sifatida ko'rsatildi, bu xususiyat benignlik bilan bog'liq, 2-holat esa aniq benign xususiyatlarga ega bo'lmagan noaniq qisman qattiq tugun sifatida ko'rsatildi. Uch bosqichli kuzatuv KT tekshiruvlari shuni ko'rsatdiki, bu holatlar 4 yil davomida barqaror bo'lib qoldi va shuning uchun benign tugunlar deb hisoblandi (4a-rasm). Ketma-ket KT tekshiruvlarining klinik bahosi bilan taqqoslaganda, mavjud tasniflagich modeli bilan bir martalik zardob metabolitlarini tahlil qilish bu benign tugunlarni ehtimoliy cheklovlar asosida tez va to'g'ri aniqladi (1-jadval). 3-holatdagi 4b-rasmda plevra retraksiya belgilari bo'lgan tugun ko'rsatilgan, bu ko'pincha xavfli o'sma bilan bog'liq32. 4-holat benign sababga oid dalillarsiz noaniq qisman qattiq tugun sifatida ko'rsatildi. Bu holatlarning barchasi klassifikator modeliga muvofiq malign deb bashorat qilingan (1-jadval). O'pka adenokarsinomasini baholash o'pka rezektsiyasi operatsiyasidan keyin gistopatologik tekshiruv orqali ko'rsatildi (4b-rasm). Tashqi validatsiya to'plami uchun metabolik klassifikator 6 mm dan katta bo'lgan noaniq o'pka tugunlarining ikkita holatini aniq bashorat qildi (10-qo'shimcha rasm).
Ikkita benign tugun holatida o'pkaning aksial oynasining KT tasvirlari. 1-holatda, 4 yildan keyin KT tekshiruvi o'ng pastki bo'lakda kalsifikatsiya bilan 7 mm o'lchamdagi barqaror qattiq tugunni ko'rsatdi. 2-holatda, 5 yildan keyin KT tekshiruvi o'ng yuqori bo'lakda diametri 7 mm bo'lgan barqaror, qisman qattiq tugunni aniqladi. b O'pkaning aksial oyna KT tasvirlari va o'pka rezektsiyasidan oldin I bosqich adenokarsinomasining ikkita holatining tegishli patologik tadqiqotlari. 3-holatda o'ng yuqori bo'lakda plevra retraksiyasi bilan diametri 8 mm bo'lgan tugun aniqlandi. 4-holatda chap yuqori bo'lakda 9 mm o'lchamdagi qisman qattiq maydalangan shisha tugun aniqlandi. Rezektsiya qilingan o'pka to'qimasini gematoksilin va eozin (H&E) bilan bo'yash (masshtab chizig'i = 50 mkm) o'pka adenokarsinomasining atsinar o'sish naqshini ko'rsatadi. Strelkalar KT tasvirlarida aniqlangan tugunlarni ko'rsatadi. H&E tasvirlari patologoanatom tomonidan tekshirilgan bir nechta (>3) mikroskopik maydonlarning vakillik tasvirlaridir.
Umuman olganda, bizning natijalarimiz o'pka tugunlarining differentsial tashxisida sarum metabolit biomarkerlarining potentsial qiymatini ko'rsatadi, bu esa KT skriningini baholashda qiyinchiliklar tug'dirishi mumkin.
Tasdiqlangan differentsial metabolitlar paneliga asoslanib, biz asosiy metabolik o'zgarishlarning biologik korrelyatlarini aniqlashga harakat qildik. MetaboAnalyst tomonidan o'tkazilgan KEGG yo'lini boyitish tahlili berilgan ikki guruh o'rtasida 6 ta umumiy sezilarli darajada o'zgargan yo'llarni aniqladi (LA vs. HC va LA vs. BN, sozlangan p ≤ 0,001, ta'sir > 0,01). Bu o'zgarishlar piruvat metabolizmi, triptofan metabolizmi, niatsin va nikotinamid metabolizmi, glikoliz, TCA sikli va purin metabolizmidagi buzilishlar bilan tavsiflangan (5a-rasm). Keyin biz mutlaq miqdoriy aniqlash yordamida asosiy o'zgarishlarni tekshirish uchun maqsadli metabolomikani amalga oshirdik. Odatda o'zgargan yo'llardagi umumiy metabolitlarni haqiqiy metabolit standartlaridan foydalangan holda uch kvadrupol massa spektrometriyasi (QQQ) yordamida aniqlash. Metabolomika tadqiqotining maqsadli namunasining demografik xususiyatlari 4-qo'shimcha jadvalda keltirilgan. Bizning global metabolomika natijalarimizga muvofiq, miqdoriy tahlil LA da gipoksantin va ksantin, piruvat va laktat miqdori BN va HC ga nisbatan ko'payganligini tasdiqladi (5b-rasm, c, p <0,05). Biroq, BN va HC o'rtasida bu metabolitlarda sezilarli farqlar topilmadi.
LA guruhidagi BN va HC guruhlariga nisbatan sezilarli darajada farq qiluvchi metabolitlarning KEGG yo'lini boyitish tahlili. Ikki dumli Globaltest qo'llanildi va p qiymatlari Holm-Bonferroni usuli yordamida sozlandi (sozlangan p ≤ 0,001 va effekt hajmi > 0,01). b–d LC-MS/MS yordamida aniqlangan zardobdagi HC, BN va LAdagi gipoksantin, ksantin, laktat, piruvat va triptofan darajasini ko'rsatuvchi skripka grafiklari (guruh uchun n = 70). Oq va qora nuqta chiziqlar mos ravishda mediana va kvartilni ko'rsatadi. e LUAD-TCGA ma'lumotlar to'plamidagi normal o'pka to'qimasi (n = 59) bilan solishtirganda o'pka adenokarsinomasida SLC7A5 va QPRT ning normallashtirilgan Log2TPM (millionga transkriptlar) mRNA ekspressiyasini (n = 513) ko'rsatuvchi skripka grafikasi. Oq katakcha kvartillararo diapazonni, markazdagi gorizontal qora chiziq medianani va katakchadan cho'zilgan vertikal qora chiziq 95% ishonch oralig'ini (CI) ifodalaydi. f TCGA ma'lumotlar to'plamida o'pka adenokarsinomasida (n = 513) va normal o'pka to'qimasida (n = 59) SLC7A5 va GAPDH ekspressiyasining Pearson korrelyatsiya grafigi. Kulrang maydon 95% CI ni ifodalaydi. r, Pearson korrelyatsiya koeffitsienti. g LC-MS/MS tomonidan aniqlangan nonspesifik shRNA nazorati (NC) va shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilan transfektsiya qilingan A549 hujayralarida normallashtirilgan hujayrali triptofan darajasi. Har bir guruhdagi beshta biologik mustaqil namunalarning statistik tahlili keltirilgan. h A549 hujayralarida (NC) va SLC7A5 nokdaun A549 hujayralarida (Sh1, Sh2) NADt ning hujayra darajasi (umumiy NAD, shu jumladan NAD+ va NADH). Har bir guruhdagi uchta biologik mustaqil namunalarning statistik tahlili keltirilgan. i SLC7A5 nokdaunidan oldin va keyin A549 hujayralarining glikolitik faolligi hujayradan tashqari kislotalanish darajasi (ECAR) bilan o'lchandi (har bir guruh uchun n = 4 ta biologik mustaqil namunalar). 2-DG, 2-deoksi-D-glyukoza. (b–h) da ikki dumli Student t testi ishlatilgan. (g–i) da xato satrlari o'rtacha ± SD ni ifodalaydi, har bir tajriba uch marta mustaqil ravishda amalga oshirildi va natijalar o'xshash edi. Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlari fayllari ko'rinishida taqdim etiladi.
LA guruhidagi o'zgargan triptofan metabolizmining sezilarli ta'sirini hisobga olgan holda, biz QQQ yordamida HC, BN va LA guruhlarida zardobdagi triptofan darajasini ham baholadik. Biz LA da zardobdagi triptofan HC yoki BN bilan solishtirganda kamayganligini aniqladik (p <0,001, 5d-rasm), bu o'pka saratoni bilan og'rigan bemorlarda qon aylanishdagi triptofan darajasi nazorat guruhidagi sog'lom nazorat guruhiga qaraganda pastroq ekanligi haqidagi avvalgi topilmalar bilan mos keladi33,34,35. PET/KT izlovchi 11C-metil-L-triptofan yordamida o'tkazilgan yana bir tadqiqotda o'pka saratoni to'qimasida triptofan signalini ushlab turish vaqti benign lezyonlar yoki normal to'qimalarga nisbatan sezilarli darajada oshganligi aniqlandi36. Biz LA zardobidagi triptofanning kamayishi o'pka saratoni hujayralari tomonidan faol triptofanning so'rilishini aks ettirishi mumkin deb taxmin qilamiz.
Shuningdek, triptofan katabolizmining kinurenin yo'lining yakuniy mahsuloti NAD+37,38 ekanligi ma'lum, bu glikolizda gliseraldegid-3-fosfatning 1,3-bisfosfogliserat bilan reaksiyasi uchun muhim substrat hisoblanadi39. Avvalgi tadqiqotlar triptofan katabolizmining immun regulyatsiyasidagi roliga qaratilgan bo'lsa-da, biz ushbu tadqiqotda kuzatilgan triptofan disregulyatsiyasi va glikolitik yo'llar o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikni aniqlashga harakat qildik. Erigan moddalarni tashuvchilar oilasi 7 a'zo 5 (SLC7A5) triptofan tashuvchisi ekanligi ma'lum43,44,45. Xinolinik kislota fosforiboziltransferaza (QPRT) - bu kinolinik kislotani NAMN46 ga aylantiradigan kinurenin yo'lining pastki qismida joylashgan ferment. LUAD TCGA ma'lumotlar to'plamini tekshirish shuni ko'rsatdiki, SLC7A5 va QPRT ham normal to'qimalarga nisbatan o'sma to'qimasida sezilarli darajada yuqori regulyatsiyaga ega (5e-rasm). Bu o'sish o'pka adenokarsinomasining I va II bosqichlarida, shuningdek, III va IV bosqichlarida kuzatildi (11-qo'shimcha rasm), bu o'sma paydo bo'lishi bilan bog'liq triptofan metabolizmining dastlabki buzilishlarini ko'rsatadi.
Bundan tashqari, LUAD-TCGA ma'lumotlar to'plami saraton kasalligiga chalingan bemorlar namunalarida SLC7A5 va GAPDH mRNK ekspressiyasi o'rtasida ijobiy korrelyatsiyani ko'rsatdi (r = 0.45, p = 1.55E-26, 5f-rasm). Aksincha, normal o'pka to'qimasida bunday gen imzolari o'rtasida sezilarli korrelyatsiya topilmadi (r = 0.25, p = 0.06, 5f-rasm). A549 hujayralarida SLC7A5 ning nokaut qilinishi (12-qo'shimcha rasm) hujayra triptofan va NAD(H) darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (5g,h-rasm), natijada hujayradan tashqari kislotalanish darajasi (ECAR) bilan o'lchangan glikolitik faollik pasaydi (1-rasm). 5i). Shunday qilib, sarumdagi metabolik o'zgarishlar va in vitro aniqlashga asoslanib, biz triptofan metabolizmi kinurenin yo'li orqali NAD+ ni ishlab chiqarishi va o'pka saratonida glikolizni rag'batlantirishda muhim rol o'ynashi mumkin degan farazni ilgari suramiz.
Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, LDCT orqali aniqlangan ko'p sonli noaniq o'pka tugunlari PET-KT, o'pka biopsiyasi va noto'g'ri ijobiy xavfli o'sma tashxisi tufayli haddan tashqari davolanish kabi qo'shimcha tekshiruvlarga ehtiyoj tug'dirishi mumkin.31 6-rasmda ko'rsatilganidek, bizning tadqiqotimiz KT orqali aniqlangan o'pka tugunlarining xavf stratifikatsiyasini va keyinchalik boshqarilishini yaxshilashi mumkin bo'lgan potentsial diagnostika qiymatiga ega bo'lgan sarum metabolitlari panelini aniqladi.
O'pka tugunlari past dozali kompyuter tomografiyasi (LDCT) yordamida baholanadi, bunda tasvirlash xususiyatlari benign yoki xavfli o'smalarning sabablarini ko'rsatadi. Tugunlarning noaniq natijasi tez-tez kuzatuvga, keraksiz aralashuvlarga va haddan tashqari davolanishga olib kelishi mumkin. Diagnostik qiymatga ega zardob metabolik klassifikatorlarini kiritish xavfni baholashni va o'pka tugunlarini keyinchalik boshqarishni yaxshilashi mumkin. PET pozitron emissiya tomografiyasi.
AQSh NLST tadqiqoti va Yevropa NELSON tadqiqoti ma'lumotlari shuni ko'rsatadiki, yuqori xavf guruhlarini past dozali kompyuter tomografiyasi (LDCT) bilan skrining qilish o'pka saratoni o'limini kamaytirishi mumkin1,3. Biroq, LDCT tomonidan aniqlangan ko'p sonli tasodifiy o'pka tugunlarini xavfni baholash va keyinchalik klinik boshqarish eng qiyin vazifa bo'lib qolmoqda. Asosiy maqsad ishonchli biomarkerlarni qo'shish orqali mavjud LDCT asosidagi protokollarni to'g'ri tasniflashni optimallashtirishdir.
Qon metabolitlari kabi ayrim molekulyar biomarkerlar o'pka saratonini sog'lom nazorat guruhi bilan taqqoslash orqali aniqlandi15,17. Ushbu tadqiqotda biz LDCT tomonidan tasodifan aniqlangan benign va malign o'pka tugunlarini ajratish uchun zardob metabolomikasi tahlilini qo'llashga e'tibor qaratdik. Biz UPLC-HRMS tahlili yordamida sog'lom nazorat (HC), benign o'pka tugunlari (BN) va I bosqich o'pka adenokarsinomasi (LA) namunalarining global zardob metabolomini taqqosladik. Biz HC va BN metabolik profillarga o'xshashligini, LA esa HC va BNga nisbatan sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatganini aniqladik. Biz LA ni HC va BN dan farqlaydigan ikkita zardob metabolitlari to'plamini aniqladik.
Xavfsiz va xavfli o'smalarni aniqlashning hozirgi LDCT asosidagi sxemasi asosan vaqt o'tishi bilan tugunlarning hajmi, zichligi, morfologiyasi va o'sish tezligiga asoslangan30. Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, tugunlarning hajmi o'pka saratoni ehtimoli bilan chambarchas bog'liq. Hatto yuqori xavf ostida bo'lgan bemorlarda ham <6 mm tugunlarda xavfli o'sma xavfi <1% ni tashkil qiladi. 6 dan 20 mm gacha bo'lgan tugunlar uchun xavfli o'sma xavfi 8% dan 64% gacha30. Shuning uchun Fleischner Jamiyati muntazam KT kuzatuvi uchun 6 mm kesish diametrini tavsiya qiladi.29 Biroq, 6 mm dan katta bo'lgan noaniq o'pka tugunlarining (IPN) xavfni baholash va davolash yetarli darajada amalga oshirilmagan31. Tug'ma yurak kasalligini hozirgi davolash odatda tez-tez KT monitoringi bilan hushyor kutishga asoslangan.
Tasdiqlangan metabolomga asoslanib, biz birinchi marta sog'lom odamlar va <6 mm benign tugunlar o'rtasidagi metabolik imzolarning bir-biriga mos kelishini ko'rsatdik. Biologik o'xshashlik avvalgi KT topilmalariga mos keladi, ya'ni <6 mm tugunlar uchun xavfli o'sma xavfi tugunsiz sub'ektlarnikiga qaraganda past.30 Shuni ta'kidlash kerakki, bizning natijalarimiz shuningdek, <6 mm va ≥6 mm benign tugunlar metabolik profillarda yuqori o'xshashlikka ega ekanligini ko'rsatadi, bu esa benign etiologiyaning funktsional ta'rifi tugun hajmidan qat'i nazar izchil ekanligini ko'rsatadi. Shunday qilib, zamonaviy diagnostik zardob metabolitlari panellari KTda tugunlar dastlab aniqlanganda istisno testi sifatida bitta tahlilni taqdim etishi va ketma-ket monitoringni kamaytirishi mumkin. Shu bilan birga, metabolik biomarkerlarning bir xil paneli ≥6 mm o'lchamdagi xavfli tugunlarni benign tugunlardan ajratib turdi va shunga o'xshash o'lchamdagi IPNlar va KT tasvirlarida noaniq morfologik xususiyatlar uchun aniq bashoratlarni taqdim etdi. Ushbu zardob metabolizmi klassifikatori ≥6 mm tugunlarning xavfli o'smasini 0,927 AUC bilan bashorat qilishda yaxshi natijalarga erishdi. Umumiy holda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, noyob zardob metabolik imzolari o'sma keltirib chiqaradigan metabolik o'zgarishlarni aks ettirishi va tugun hajmidan qat'i nazar, xavfni bashorat qiluvchi omillar sifatida potentsial qiymatga ega bo'lishi mumkin.
Shunisi e'tiborga loyiqki, o'pka adenokarsinomasi (LUAD) va skuamoz hujayrali karsinoma (LUSC) mayda hujayrali bo'lmagan o'pka saratonining (NSCLC) asosiy turlari hisoblanadi. LUSC tamaki iste'moli bilan chambarchas bog'liqligini47 va LUAD KT skriningida aniqlangan tasodifiy o'pka tugunlarining eng keng tarqalgan gistologiyasi ekanligini48 hisobga olgan holda, bizning klassifikator modelimiz I bosqich adenokarsinoma namunalari uchun maxsus yaratilgan. Vang va hamkasblari shuningdek, LUADga e'tibor qaratdilar va sog'lom odamlardan erta bosqichdagi o'pka saratonini ajratish uchun lipidomik vositalardan foydalangan holda to'qqizta lipid imzosini aniqladilar17. Biz hozirgi klassifikator modelini I bosqich LUSCning 16 ta holati va 74 ta benign tugunlarda sinab ko'rdik va LUSC bashorat qilishning past aniqligini (AUC 0.776) kuzatdik, bu LUAD va LUSC o'zlarining metabolik imzolariga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Darhaqiqat, LUAD va LUSC etiologiyasi, biologik kelib chiqishi va genetik aberratsiyalari jihatidan farq qilishi ko'rsatilgan49. Shuning uchun, skrining dasturlarida o'pka saratonini populyatsiya asosida aniqlash bo'yicha o'quv modellariga boshqa turdagi gistologiyalar kiritilishi kerak.
Bu yerda biz sog'lom nazorat guruhi va benign tugunlarga nisbatan o'pka adenokarsinomasida eng ko'p o'zgargan oltita yo'lni aniqladik. Ksantin va gipoksantin purin metabolik yo'lining keng tarqalgan metabolitlari hisoblanadi. Bizning natijalarimizga muvofiq, purin metabolizmi bilan bog'liq oraliq mahsulotlar sog'lom nazorat guruhi yoki preinvaziv bosqichdagi bemorlarga nisbatan o'pka adenokarsinomasi bilan og'rigan bemorlarning zardobida yoki to'qimalarida sezilarli darajada oshdi15,50. Zardobdagi ksantin va gipoksantin darajasining ko'tarilishi tez ko'payuvchi saraton hujayralari tomonidan talab qilinadigan anabolizmni aks ettirishi mumkin. Glyukoza metabolizmining buzilishi saraton metabolizmining taniqli belgisidir51. Bu yerda biz HC va BN guruhiga nisbatan LA guruhida piruvat va laktatning sezilarli darajada oshganini kuzatdik, bu kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratoni (NSCLC) bemorlari va sog'lom nazorat guruhining zardob metabolom profillarida glikolitik yo'l anomaliyalari haqidagi avvalgi xabarlarga mos keladi. Natijalar izchil52,53.
Muhimi, biz o'pka adenokarsinomalari zardobida piruvat va triptofan metabolizmi o'rtasida teskari korrelyatsiyani kuzatdik. LA guruhida zardobdagi triptofan darajasi HC yoki BN guruhiga nisbatan kamaydi. Qizig'i shundaki, istiqbolli kohort yordamida o'tkazilgan avvalgi keng ko'lamli tadqiqot shuni ko'rsatdiki, qon aylanish tizimidagi triptofanning past darajasi o'pka saratoni xavfining ortishi bilan bog'liq 54. Triptofan biz butunlay oziq-ovqatdan oladigan muhim aminokislotadir. Biz o'pka adenokarsinomasida zardobdagi triptofanning kamayishi ushbu metabolitning tez kamayishini aks ettirishi mumkin degan xulosaga keldik. Kinurenin yo'li orqali triptofan katabolizmining yakuniy mahsuloti de novo NAD+ sintezining manbai ekanligi yaxshi ma'lum. NAD+ asosan qutqaruv yo'li orqali ishlab chiqarilganligi sababli, sog'liq va kasallikdagi triptofan metabolizmidagi NAD+ ning ahamiyati aniqlanmagan46. TCGA ma'lumotlar bazasini tahlil qilishimiz shuni ko'rsatdiki, triptofan tashuvchisi erigan modda tashuvchisi 7A5 (SLC7A5) ning ifodalanishi o'pka adenokarsinomasida normal nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshgan va GAPDH glikolitik fermentining ifodalanishi bilan ijobiy bog'liqlikda bo'lgan. Avvalgi tadqiqotlar asosan triptofan katabolizmining o'smaga qarshi immunitet reaksiyasini bostirishdagi roliga qaratilgan edi40,41,42. Bu yerda biz o'pka saraton hujayralarida SLC7A5 ni nokdaun qilish orqali triptofanning qabul qilinishini inhibe qilish keyinchalik hujayra NAD darajasining pasayishiga va glikolitik faollikning pasayishiga olib kelishini ko'rsatamiz. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz o'pka adenokarsinomasining xavfli transformatsiyasi bilan bog'liq zardob metabolizmidagi o'zgarishlar uchun biologik asos yaratadi.
EGFR mutatsiyalari NSCLC bilan og'rigan bemorlarda eng ko'p uchraydigan qo'zg'atuvchi mutatsiyalardir. Bizning tadqiqotimizda EGFR mutatsiyasiga ega bemorlarda (n = 41) umumiy metabolik profillar yovvoyi tipdagi EGFR (n = 31) bilan og'rigan bemorlarga o'xshashligini aniqladik, ammo asilkarnitinli bemorlarda ba'zi EGFR mutant bemorlarida sarum darajasining pasayishini aniqladik. Asilkarnitinlarning aniqlangan vazifasi asil guruhlarini sitoplazmadan mitoxondrial matritsaga tashishdir, bu esa yog 'kislotalarining oksidlanishiga olib keladi va energiya hosil qiladi 55. Bizning topilmalarimizga muvofiq, yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda 102 ta o'pka adenokarsinomasi to'qima namunalarining global metabolomini tahlil qilish orqali EGFR mutant va EGFR yovvoyi tipdagi o'smalar o'rtasida o'xshash metabolom profillari aniqlandi50. Qizig'i shundaki, asilkarnitin miqdori EGFR mutant guruhida ham topilgan. Shuning uchun, asilkarnitin darajasidagi o'zgarishlar EGFR tomonidan qo'zg'atilgan metabolik o'zgarishlarni va uning ostidagi molekulyar yo'llarni aks ettiradimi yoki yo'qmi, qo'shimcha tadqiqotlarga arziydi.
Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz o'pka tugunlarining differentsial diagnostikasi uchun sarum metabolik klassifikatorini yaratadi va KT tekshiruvi asosida xavfni baholashni optimallashtirish va klinik boshqaruvni osonlashtirishi mumkin bo'lgan ish jarayonini taklif qiladi.
Ushbu tadqiqot Sun Yat-sen universiteti saraton kasalxonasining axloq qo'mitasi, Sun Yat-sen universitetining birinchi filial kasalxonasi va Zhengzhou universiteti saraton kasalxonasining axloq qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Kashfiyot va ichki tasdiqlash guruhlarida Sun Yat-sen universiteti saraton markazining saratonni nazorat qilish va oldini olish bo'limida yillik tibbiy ko'rikdan o'tayotgan shaxslardan sog'lom odamlardan 174 ta zardob va benign tugunlardan 244 ta zardob va Sun Yat-sen universiteti saraton markazidan 166 ta benign tugunlar to'plangan. I bosqich o'pka adenokarsinomalari to'plangan. Tashqi tasdiqlash kohortasida Sun Yat-sen universitetining birinchi filial kasalxonasidan benign tugunlarning 48 ta holati, I bosqich o'pka adenokarsinomasining 39 ta holati va Zhengzhou saraton kasalxonasidan I bosqich o'pka adenokarsinomasining 24 ta holati mavjud edi. Sun Yat-sen universiteti saraton markazi shuningdek, belgilangan metabolik klassifikatorning diagnostika qobiliyatini tekshirish uchun I bosqich skuamoz hujayrali o'pka saratonining 16 ta holatini to'pladi (bemorlarning xususiyatlari 5-qo'shimcha jadvalda ko'rsatilgan). Kashfiyot kohortasi va ichki tasdiqlash kohortasidan namunalar 2018-yil yanvar va 2020-yil may oylari oralig'ida to'plandi. Tashqi tasdiqlash kohortasi uchun namunalar 2021-yil avgust va 2022-yil oktyabr oylari oralig'ida to'plandi. Jinsga nisbatan tarafkashlikni minimallashtirish uchun har bir kohortaga taxminan teng miqdordagi erkak va ayol holatlari biriktirildi. Kashfiyot guruhi va ichki ko'rib chiqish guruhi. Ishtirokchining jinsi o'z-o'zini hisobot qilish asosida aniqlandi. Barcha ishtirokchilardan xabardor rozilik olindi va hech qanday kompensatsiya berilmadi. Xavfsiz tugunlari bo'lgan sub'ektlar tahlil vaqtida 2 yildan 5 yilgacha barqaror KT tekshiruvi baliga ega bo'lganlar edi, tashqi tasdiqlash namunasidan 1 ta holat bundan mustasno, ular operatsiyadan oldin to'plangan va gistopatologiya yordamida tashxis qo'yilgan. Surunkali bronxit bundan mustasno. O'pka adenokarsinomasi holatlari o'pka rezektsiyasidan oldin to'plangan va patologik tashxis bilan tasdiqlangan. Ro'za qon namunalari antikoagulyantlarsiz sarum ajratish naychalarida to'plangan. Qon namunalari xona haroratida 1 soat davomida ivib olindi va keyin zardob ustki qatlamini yig'ish uchun 4°C da 10 daqiqa davomida 2851 × g da santrifuga qilindi. Zardob alikvotlari metabolit ekstraksiya qilinmaguncha -80°C da muzlatildi. Sun Yat-sen universiteti saraton markazining saraton kasalligining oldini olish va tibbiy ko'rik bo'limi 40 yoshdan 55 yoshgacha bo'lgan teng miqdordagi erkaklar va ayollarni o'z ichiga olgan 100 ta sog'lom donordan zardob pulini to'pladi. Har bir donor namunasining teng hajmlari aralashtirildi, natijada olingan pul alikvotatsiya qilindi va -80°C da saqlandi. Zardob aralashmasi sifat nazorati va ma'lumotlarni standartlashtirish uchun ma'lumotnoma sifatida ishlatilgan.
Malumot sarum va sinov namunalari eritildi va metabolitlar birlashtirilgan ekstraksiya usuli (MTBE/metanol/suv) yordamida ekstraksiya qilindi 56. Qisqacha aytganda, 50 mkl sarum 225 mkl muzdek metanol va 750 mkl muzdek metil tert-butil efir (MTBE) bilan aralashtirildi. Aralashmani aralashtiring va muz ustida 1 soat davomida inkubatsiya qiling. Keyin namunalar aralashtirildi va ichki standartlarni (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin va 13C6-izoleysin, Kembrij Izotop Laboratoriyalaridan sotib olingan) o'z ichiga olgan 188 mkl MS darajasidagi suv bilan aralashtirildi. Keyin aralashma 4 °C da 10 daqiqa davomida 15000 × g da santrifuga qilindi va pastki faza musbat va manfiy rejimlarda LC-MS tahlili uchun ikkita naychaga (har biri 125 mkl) o'tkazildi. Nihoyat, namuna yuqori tezlikdagi vakuumli konsentratorda quruq bo'lguncha bug'latildi.
Quritilgan metabolitlar 120 mkl 80% asetonitrilda qayta tiklandi, 5 daqiqa davomida vortekslandi va 4°C da 10 daqiqa davomida 15000 × g tezlikda santrifugalandi. Supernatantlar metabolomika tadqiqotlari uchun mikroinsertlar bilan kehribar shisha flakonlarga o'tkazildi. Ultra samarali suyuqlik xromatografiyasi-yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) platformasida maqsadsiz metabolomika tahlili. Metabolitlar Dionex Ultimate 3000 UPLC tizimi va ACQUITY BEH Amid ustuni (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) yordamida ajratildi. Musbat ion rejimida harakatlanuvchi fazalar 95% (A) va 50% asetonitril (B) bo'lib, ularning har biri 10 mmol/L ammoniy asetat va 0.1% chumoli kislotasini o'z ichiga olgan. Salbiy rejimda A va B harakatlanuvchi fazalari mos ravishda 95% va 50% asetonitrilni o'z ichiga olgan, ikkala faza ham 10 mmol/L ammoniy asetatni o'z ichiga olgan, pH = 9. Gradient dasturi quyidagicha edi: 0–0,5 daqiqa, 2% B; 0,5–12 daqiqa, 2–50% B; 12–14 daqiqa, 50–98% B; 14–16 daqiqa, 98% B; 16–16,1 daqiqa, 98–2% B; 16,1–20 daqiqa, 2% B. Avtosamplerda ustun 40°C da, namuna esa 10°C da saqlangan. Oqim tezligi 0,3 ml/min, in'ektsiya hajmi 3 mkl edi. Elektrospray ionizatsiyasi (ESI) manbaiga ega Q-Exactive Orbitrap mass-spektrometri (Thermo Fisher Scientific) to'liq skanerlash rejimida ishladi va katta hajmdagi ma'lumotlarni to'plash uchun ddMS2 monitoring rejimi bilan birlashtirildi. MS parametrlari quyidagicha o'rnatildi: purkash kuchlanishi +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillyar harorat 320°C, himoya gazi 40 arb, yordamchi gaz 10 arb, zond isitgichi harorati 350°C, skanerlash diapazoni 70–1050 m/soat, aniqlik 70 000. Ma'lumotlar Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) yordamida olindi.
Ma'lumotlar sifatini baholash uchun har bir namunadan 10 mkL supernatant alikvotlarini olib tashlash orqali birlashtirilgan sifat nazorati (QC) namunalari yaratildi. UPLC-MS tizimining barqarorligini baholash uchun analitik ketma-ketlik boshida oltita sifat nazorati namunasi in'ektsiyasi tahlil qilindi. Keyin sifat nazorati namunalari vaqti-vaqti bilan partiyaga kiritiladi. Ushbu tadqiqotdagi barcha 11 partiya zardob namunalari LC-MS yordamida tahlil qilindi. Ekstraksiya jarayonini kuzatish va partiyadan partiyaga ta'sirini sozlash uchun 100 ta sog'lom donorlardan olingan zardob hovuzi aralashmasining alikvotlari tegishli partiyalarda ma'lumotnoma sifatida ishlatilgan. Sun Yat-sen universitetining Metabolomika markazida kashfiyot kohortasi, ichki validatsiya kohortasi va tashqi validatsiya kohortasining maqsadsiz metabolomika tahlili o'tkazildi. Guangdong Texnologiya Universiteti tahlil va sinov markazining tashqi laboratoriyasi ham klassifikator modelining ishlashini sinab ko'rish uchun tashqi kohortadan 40 ta namunani tahlil qildi.
Ekstraksiya va qayta tiklashdan so'ng, zardob metabolitlarining mutlaq miqdori ko'p reaksiya monitoringi (MRM) rejimida elektropurkagich ionizatsiyasi (ESI) manbai bilan ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi-tandem massa spektrometriyasi (Agilent 6495 uch karra kvadrupol) yordamida o'lchandi. Metabolitlarni ajratish uchun ACQUITY BEH Amid ustuni (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) ishlatilgan. Ko'chma faza 90% (A) va 10 mmol/L ammoniy asetat va 0.1% ammiak eritmasi bilan 5% asetonitril (B) dan iborat edi. Gradient dasturi quyidagicha edi: 0–1.5 daqiqa, 0% B; 1.5–6.5 daqiqa, 0–15% B; 6.5–8 daqiqa, 15% B; 8–8.5 daqiqa, 15%–0% B; 8.5–11.5 daqiqa, 0%B. Avtosamplerda ustun 40 °C da, namuna esa 10 °C da saqlangan. Oqim tezligi 0,3 ml/min va in'ektsiya hajmi 1 mkL ni tashkil etdi. MS parametrlari quyidagicha o'rnatildi: kapillyar kuchlanish ±3,5 kV, nebulizer bosimi 35 psi, qobiq gaz oqimi 12 L/min, qobiq gaz harorati 350 °C, quritish gaz harorati 250 °C va quritish gaz oqimi 14 l/min. Triptofan, piruvat, laktat, gipoksantin va ksantinning MRM konversiyalari mos ravishda 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 va 151,0–107,9 ni tashkil etdi. Ma'lumotlar Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) yordamida to'plangan. Zardob namunalari uchun triptofan, piruvat, laktat, gipoksantin va ksantin standart aralashma eritmalarining kalibrlash egri chiziqlari yordamida aniqlandi. Hujayra namunalari uchun triptofan miqdori ichki standart va hujayra oqsil massasiga normallashtirildi.
Cho'qqi ekstraktsiyasi (m/z va saqlash vaqti (RT)) Compound Discovery 3.1 va TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) yordamida amalga oshirildi. Partiyalar orasidagi potentsial farqlarni bartaraf etish uchun sinov namunasining har bir xarakterli cho'qqisi nisbiy mo'l-ko'llikni olish uchun bir xil partiyadan olingan mos yozuvlar materialining xarakterli cho'qqisiga bo'lindi. Standartlashtirishdan oldin va keyin ichki standartlarning nisbiy standart og'ishlari 6-qo'shimcha jadvalda ko'rsatilgan. Ikki guruh o'rtasidagi farqlar noto'g'ri kashfiyot darajasi (FDR<0.05, Wilcoxon imzolangan daraja testi) va buklanish o'zgarishi (>1.2 yoki <0.83) bilan tavsiflangan. Ekstraksiya qilingan xususiyatlarning xom MS ma'lumotlari va mos yozuvlar sarum bilan tuzatilgan MS ma'lumotlari mos ravishda 1-qo'shimcha ma'lumotlar va 2-qo'shimcha ma'lumotlarda ko'rsatilgan. Cho'qqi annotatsiyasi aniqlangan metabolitlar, taxminiy izohlangan birikmalar, taxminiy tavsiflangan birikma sinflari va noma'lum birikmalar 22 ni o'z ichiga olgan to'rtta aniqlangan identifikatsiya darajasiga asoslanib amalga oshirildi. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) ma'lumotlar bazasidagi qidiruvlarga asoslanib, MS/MS ga mos keladigan tasdiqlangan standartlarga yoki mzCloud (ball > 85) yoki Chemspider ga aniq mos keladigan annotatsiyalarga ega biologik birikmalar nihoyat differentsial metabolom orasidagi oraliq mahsulotlar sifatida tanlandi. Har bir xususiyat uchun eng yuqori annotatsiyalar Qo'shimcha ma'lumotlar 3 ga kiritilgan. MetaboAnalyst 5.0 yig'indisi normallashtirilgan metabolitlar ko'pligining bir o'zgaruvchili tahlili uchun ishlatilgan. MetaboAnalyst 5.0 shuningdek, sezilarli darajada farq qiladigan metabolitlarga asoslangan KEGG yo'lini boyitish tahlilini baholadi. Asosiy komponentlar tahlili (PCA) va qisman eng kichik kvadratlar diskriminant tahlili (PLS-DA) ropls dasturiy ta'minot paketi (v.1.26.4) yordamida stek normalizatsiyasi va avtoskalalash bilan tahlil qilindi. Tugunlarning xavfli o'sishini bashorat qilish uchun optimal metabolit biomarker modeli eng kam mutlaq qisqarish va tanlash operatori (LASSO, R paketi v.4.1-3) bilan ikkilik logistik regressiya yordamida yaratildi. Diskriminant modelning aniqlash va tasdiqlash to'plamlaridagi ishlashi pROC paketiga (v.1.18.0.) muvofiq ROC tahliliga asoslangan AUC ni baholash orqali tavsiflandi. Optimal ehtimollik chegarasi modelning maksimal Youden indeksi (sezgirlik + o'ziga xoslik – 1) asosida olindi. Oraliq qiymatdan past yoki kattaroq qiymatlarga ega namunalar mos ravishda benign tugunlar va o'pka adenokarsinomasi sifatida bashorat qilinadi.
A549 hujayralari (#CCL-185, Amerika tipidagi madaniyat to'plami) 10% FBS o'z ichiga olgan F-12K muhitida o'stirildi. SLC7A5 ni nishonga oluvchi qisqa sochli RNK (shRNA) ketma-ketliklari va nishonga olinmaydigan nazorat (NC) lentivirusli pLKO.1-puro vektoriga kiritildi. shSLC7A5 ning antisens ketma-ketliklari quyidagicha: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5 (#5347) va tubulin (#2148) ga qarshi antitelalar Cell Signaling Technology kompaniyasidan sotib olindi. Western blot tahlili uchun SLC7A5 va tubulinga qarshi antitelalar 1:1000 suyultirilgan holda ishlatilgan.
Seahorse XF glikolitik stress testi hujayradan tashqari kislotalanish (ECAR) darajasini o'lchaydi. Tahlilda ECAR yordamida o'lchangan hujayra glikolitik qobiliyatini tekshirish uchun glyukoza, oligomitsin A va 2-DG ketma-ket yuborildi.
Nishonga olinmagan nazorat (NC) va shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilan transfektsiya qilingan A549 hujayralari 10 sm diametrli idishlarga bir kechada joylashtirildi. Hujayra metabolitlari 1 ml muzdek 80% suvli metanol bilan ekstraksiya qilindi. Metanol eritmasidagi hujayralar qirib olindi, yangi naychaga yig'ildi va 15 000 × g tezlikda 4°C da 15 daqiqa davomida santrifuga qilindi. 800 µl supernatantni yig'ib oling va yuqori tezlikdagi vakuum konsentratori yordamida quriting. Keyin quritilgan metabolit granulalari yuqorida tavsiflanganidek LC-MS/MS yordamida triptofan darajasi bo'yicha tahlil qilindi. A549 hujayralaridagi (NC va shSLC7A5) hujayra NAD(H) darajalari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq miqdoriy NAD+/NADH kolorimetrik to'plami (#K337, BioVision) yordamida o'lchandi. Metabolitlar miqdorini normallashtirish uchun har bir namunada oqsil darajasi o'lchandi.
Namuna hajmini oldindan aniqlash uchun statistik usullar qo'llanilmagan. Biomarkerlarni kashf etishga qaratilgan avvalgi metabolomika tadqiqotlari15,18 o'lchamni aniqlash uchun mezon sifatida ko'rib chiqilgan va ushbu hisobotlar bilan taqqoslaganda, bizning namunamiz yetarli edi. Tadqiqot kohortasidan hech qanday namunalar chiqarib tashlanmadi. Maqsadsiz metabolomika tadqiqotlari uchun sarum namunalari tasodifiy ravishda kashfiyot guruhiga (306 ta holat, 74,6%) va ichki tasdiqlash guruhiga (104 ta holat, 25,4%) ajratildi. Shuningdek, biz maqsadli metabolomika tadqiqotlari uchun kashfiyotlar to'plamidan har bir guruhdan tasodifiy ravishda 70 ta holatni tanladik. Tadqiqotchilar LC-MS ma'lumotlarini to'plash va tahlil qilish paytida guruhlarni taqsimlashdan mahrum bo'lishdi. Metabolomika ma'lumotlari va hujayra tajribalarining statistik tahlillari tegishli Natijalar, Rasm afsonalari va Usullar bo'limlarida tasvirlangan. Hujayra triptofan, NADT va glikolitik faollikni miqdoriy aniqlash bir xil natijalar bilan uch marta mustaqil ravishda amalga oshirildi.
Tadqiqot dizayni haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun ushbu maqola bilan bog'liq Tabiiy portfel hisoboti qisqacha mazmuniga qarang.
Olingan xususiyatlarning xom MS ma'lumotlari va mos yozuvlar zardobining normallashtirilgan MS ma'lumotlari mos ravishda 1-qo'shimcha ma'lumotlar va 2-qo'shimcha ma'lumotlarda ko'rsatilgan. Differentsial xususiyatlar uchun eng yuqori annotatsiyalar 3-qo'shimcha ma'lumotlarda keltirilgan. LUAD TCGA ma'lumotlar to'plamini https://portal.gdc.cancer.gov/ dan yuklab olish mumkin. Grafikni chizish uchun kirish ma'lumotlari manba ma'lumotlarida keltirilgan. Manba ma'lumotlari ushbu maqola uchun keltirilgan.
Milliy o'pka skriningi bo'yicha tadqiqot guruhi va boshqalar. Past dozali kompyuter tomografiyasi yordamida o'pka saratonidan o'limni kamaytirish. Shimoliy Angliya. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR va Prophet, PC Past dozali spiral KT yordamida o'pka saratonini skrining qilish: Milliy o'pka skriningi tadqiqoti (NLST) natijalari. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ va boshqalar. Tasodifiy sinovda hajmli KT skriningi yordamida o'pka saratonidan o'limni kamaytirish. Shimoliy Angliya. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Nashr vaqti: 2023-yil 18-sentabr