Kompyuter tomografiyasi (KT) bilan aniqlangan o'pka tugunlarining differentsial diagnostikasi klinik amaliyotda muammo bo'lib qolmoqda.Bu erda biz 480 ta sarum namunalarining global metabolomini, shu jumladan sog'lom nazorat, yaxshi o'pka tugunlari va I bosqich o'pka adenokarsinomasini tavsiflaymiz.Adenokarsinomalar o'ziga xos metabolik profillarni namoyish etadi, holbuki benign tugunlar va sog'lom odamlar metabolomik profillarda yuqori o'xshashlikka ega.Kashfiyot guruhida (n = 306) benign va malign tugunlarni farqlash uchun 27 ta metabolitlar to'plami aniqlandi.Ichki tekshirish (n = 104) va tashqi tekshirish (n = 111) guruhlaridagi diskriminant modelining AUC mos ravishda 0,915 va 0,945 edi.Yo'l tahlili yaxshi nodullar va sog'lom nazorat bilan solishtirganda o'pka adenokarsinomasi zardobida triptofanning kamayishi bilan bog'liq bo'lgan glikolitik metabolitlarning ko'payishini aniqladi va triptofanni qabul qilish o'pka saratoni hujayralarida glikolizga yordam berishini taklif qildi.Bizning tadqiqotimiz KT tomonidan aniqlangan o'pka tugunlari xavfini baholashda sarum metabolitlari biomarkerlarining qiymatini ta'kidlaydi.
Erta tashxis qo'yish saraton kasalligining omon qolish darajasini oshirish uchun juda muhimdir.AQSh Milliy o'pka saratoni skrining sinovi (NLST) va Yevropa NELSON tadqiqoti natijalari shuni ko'rsatdiki, past dozali kompyuter tomografiyasi (LDCT) bilan skrining yuqori xavfli guruhlarda o'pka saratoni o'limini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin1,2,3.O'pka saratoni skriningi uchun LDCT keng qo'llanilgandan beri, asemptomatik o'pka tugunlarining tasodifiy rentgenografik topilmalari chastotasi o'sishda davom etdi 4 .O'pka tugunlari diametri 5 ga teng bo'lgan 3 sm gacha bo'lgan fokal opasiteler sifatida aniqlanadi.Biz LDCTda tasodifan aniqlangan ko'p miqdordagi o'pka tugunlari bilan shug'ullanish va malignite ehtimolini baholashda qiyinchiliklarga duch kelamiz.KT cheklovlari tez-tez kuzatuv tekshiruvlari va noto'g'ri ijobiy natijalarga olib kelishi mumkin, bu esa keraksiz aralashuvga va ortiqcha davolanishga olib keladi6.Shu sababli, dastlabki bosqichlarda o'pka saratonini to'g'ri aniqlash va dastlabki aniqlashda 7 ko'pchilik benign tugunlarni farqlash uchun ishonchli va foydali biomarkerlarni ishlab chiqish zarurati mavjud.
Qonning keng qamrovli molekulyar tahlili (zardob, plazma, periferik qonning mononuklear hujayralari), shu jumladan genomika, proteomika yoki DNK metilatsiyasi8,9,10, o'pka saratoni diagnostik biomarkerlarini kashf etishga qiziqishning ortishiga olib keldi.Shu bilan birga, metabolomik yondashuvlar endogen va ekzogen ta'sirlar ta'sirida bo'lgan hujayrali yakuniy mahsulotlarni o'lchaydi va shuning uchun kasallikning boshlanishi va natijalarini bashorat qilish uchun qo'llaniladi.Suyuq xromatografiya-tandem massa spektrometriyasi (LC-MS) o'zining yuqori sezuvchanligi va katta dinamik diapazoni tufayli metabolomik tadqiqotlar uchun keng qo'llaniladigan usul bo'lib, u turli fizik-kimyoviy xususiyatlarga ega metabolitlarni qamrab oladi11,12,13.Plazma/zardobning global metabolomik tahlili o'pka saratoni diagnostikasi14,15,16,17 va davolash samaradorligi bilan bog'liq biomarkerlarni aniqlash uchun ishlatilgan bo'lsa-da, benign va malign o'pka tugunlarini ajratish uchun sarum metabolitlari tasniflagichlari hali ham ko'p o'rganilishi kerak.- keng ko'lamli tadqiqotlar.
Adenokarsinoma va skuamoz hujayrali karsinoma kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratonining (NSCLC) ikkita asosiy kichik turidir.Turli KT skrining testlari adenokarsinoma o'pka saratonining eng keng tarqalgan gistologik turi ekanligini ko'rsatadi1,19,20,21.Ushbu tadqiqotda biz sog'lom nazorat, yaxshi o'pka tugunlari va CT tomonidan aniqlangan ≤3 sm ni o'z ichiga olgan jami 695 sarum namunalarida metabolomik tahlilni o'tkazish uchun ultra samarali suyuqlik xromatografiyasi - yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasidan (UPLC-HRMS) foydalandik.I bosqich o'pka adenokarsinomasi uchun skrining.Biz o'pka adenokarsinomasini yaxshi tugunlardan va sog'lom nazoratdan ajratib turadigan sarum metabolitlari panelini aniqladik.Yo'lni boyitish tahlili shuni ko'rsatdiki, g'ayritabiiy triptofan va glyukoza almashinuvi o'pka adenokarsinomasida yaxshi tugunlar va sog'lom nazorat bilan solishtirganda keng tarqalgan o'zgarishlardir.Nihoyat, biz LDCT tomonidan aniqlangan malign va benign o'pka tugunlarini ajratish uchun yuqori o'ziga xoslik va sezuvchanlikka ega bo'lgan sarum metabolik klassifikatorini yaratdik va tasdiqladik, bu erta differentsial tashxis va xavfni baholashga yordam beradi.
Joriy tadqiqotda 174 nafar sog'lom nazorat vakillaridan, yaxshi o'pka tugunlari bo'lgan 292 bemordan va I bosqich o'pka adenokarsinomasi bo'lgan 229 bemordan jinsi va yoshiga mos sarum namunalari retrospektiv tarzda to'plangan.695 ta sub'ektning demografik xususiyatlari qo'shimcha 1-jadvalda keltirilgan.
Shakl 1a da ko'rsatilganidek, Sun Yat-sen universiteti saraton markazida jami 480 ta sarum namunalari, jumladan, 174 ta sog'lom nazorat (HC), 170 ta benign nodul (BN) va 136 ta I bosqich o'pka adenokarsinomasi (LA) namunalari to'plangan.Ultra samarali suyuq xromatografiya - yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) yordamida maqsadsiz metabolomik profilni aniqlash uchun kashfiyot kohorti.Qo'shimcha 1-rasmda ko'rsatilganidek, LA va HC, LA va BN o'rtasidagi differentsial metabolitlar tasniflash modelini yaratish va differentsial yo'l tahlilini yanada o'rganish uchun aniqlandi.Sun Yat-sen universiteti saraton markazi tomonidan to'plangan 104 ta namuna va boshqa ikkita shifoxona tomonidan to'plangan 111 ta namuna mos ravishda ichki va tashqi tekshiruvdan o'tkazildi.
Ultra samarali suyuqlik xromatografiyasi-yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) yordamida global sarum metabolomikasi tahlilidan o'tgan kashfiyot kohortidagi tadqiqot populyatsiyasi.b Tadqiqot kohortidagi 480 ta sarum namunalarining umumiy metabolomining qisman eng kichik kvadratchalari diskriminant tahlili (PLS-DA), shu jumladan sog'lom nazorat (HC, n = 174), yaxshi tugunlar (BN, n = 170) va I bosqich o'pka adenokarsinomasi (Los-Anjeles, n = 136).+ESI, musbat elektrosprey ionlash rejimi, -ESI, salbiy elektrosprey ionlash rejimi.c–e Ikki berilgan guruhda sezilarli darajada farq qiluvchi metabolitlar (ikki dumli Uilkoxon imzolangan daraja testi, noto‘g‘ri aniqlash tezligi sozlangan p qiymati, FDR <0,05) qizil (qatlam o‘zgarishi > 1,2) va ko‘k (qatlam o‘zgarishi < 0,83) bilan ko‘rsatilgan. .) vulqon grafikida ko'rsatilgan.f LA va BN o'rtasidagi izohli metabolitlar sonida sezilarli farqlarni ko'rsatadigan ierarxik klasterli issiqlik xaritasi.Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
UPLC-HRMS tahlili yordamida kashfiyot guruhidagi 174 HC, 170 BN va 136 LA ning umumiy sarum metabolomi tahlil qilindi.Biz birinchi navbatda sifat nazorati (QC) namunalari nazoratsiz asosiy komponentlar tahlili (PCA) modelining markazida zich joylashganligini ko'rsatamiz, bu joriy tadqiqot samaradorligining barqarorligini tasdiqlaydi (2-rasm).
Shakl 1 b dagi qisman eng kichik kvadratchalar-diskriminant tahlilida (PLS-DA) ko'rsatilgandek, biz LA va BN, LA va HC o'rtasida ijobiy (+ESI) va salbiy (-ESI) elektrosprey ionlash rejimlarida aniq farqlar borligini aniqladik. .izolyatsiya qilingan.Biroq, +ESI va -ESI sharoitida BN va HC o'rtasida sezilarli farqlar topilmadi.
Biz LA va HC o'rtasida 382 ta differentsial xususiyatni, LA va BN o'rtasida 231 ta differensial xususiyatni va BN va HC o'rtasida 95 ta differentsial xususiyatni topdik (Uilkoxon tomonidan imzolangan darajali test, FDR <0,05 va ko'p o'zgarish >1,2 yoki <0,83) (1c-e-rasm). )..Cho'qqilar ma'lumotlar bazasiga (mzCloud/HMDB/Chemspider kutubxonasi) nisbatan m/z qiymati, saqlash vaqti va parchalanish massa spektrini qidirish (batafsil ma'lumotlar Usullar bo'limida tasvirlangan) 22 bo'yicha qo'shimcha izohlangan (Qo'shimcha ma'lumotlar 3).Nihoyat, ko'pligida sezilarli farqlarga ega 33 va 38 izohli metabolitlar mos ravishda LA va BN (1f-rasm va 2-jadval) va LA-ga nisbatan HC (qo'shimcha 3-rasm va 2-jadval) uchun aniqlandi.Bundan farqli o'laroq, BN va HCda ko'pligida sezilarli farqlarga ega bo'lgan faqat 3 ta metabolit aniqlandi (qo'shimcha jadval 2), PLS-DA da BN va HC o'rtasidagi o'xshashlik bilan mos keladi.Ushbu differentsial metabolitlar biokimyoviy moddalarning keng doirasini qamrab oladi (Qo'shimcha 4-rasm).Birgalikda bu natijalar yaxshi o'pka tugunlari yoki sog'lom sub'ektlar bilan solishtirganda erta bosqichdagi o'pka saratonining malign transformatsiyasini aks ettiruvchi sarum metabolomidagi sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatadi.Shu bilan birga, BN va HC zardobidagi metabolomalarining o'xshashligi yaxshi o'pka tugunlari sog'lom odamlar bilan ko'plab biologik xususiyatlarga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.Epidermal o'sish omili retseptorlari (EGFR) gen mutatsiyalari o'pka adenokarsinomasining 23 kichik turida keng tarqalganligini hisobga olib, biz haydovchi mutatsiyalarining sarum metabolomiga ta'sirini aniqlashga harakat qildik.Keyin o'pka adenokarsinomasi guruhida EGFR holati bo'lgan 72 ta holatning umumiy metabolomik profilini tahlil qildik.Qizig'i shundaki, biz PCA tahlilida EGFR mutant bemorlari (n = 41) va EGFR yovvoyi tipidagi bemorlar (n = 31) o'rtasida taqqoslanadigan profillarni topdik (Qo'shimcha rasm 5a).Biroq, biz EGFR mutatsiyasiga ega bo'lgan bemorlarda ko'pligi yovvoyi turdagi EGFR bo'lgan bemorlarga nisbatan sezilarli darajada o'zgargan 7 ta metabolitni aniqladik (t testi, p <0,05 va qatlam o'zgarishi> 1,2 yoki <0,83) (Qo'shimcha rasm 5b).Ushbu metabolitlarning aksariyati (7 tadan 5 tasi) yog 'kislotalarining oksidlanish yo'llarida muhim rol o'ynaydigan asilkarnitinlardir.
Shakl 2 a da ko'rsatilgan ish oqimida ko'rsatilgandek, tugunlarni tasniflash uchun biomarkerlar eng kam mutlaq qisqarish operatorlari va LA (n = 136) va BN (n = 170) da aniqlangan 33 ta differentsial metabolitlarga asoslangan tanlov yordamida olingan.O'zgaruvchilarning eng yaxshi kombinatsiyasi (LASSO) - ikkilik logistik regressiya modeli.Modelning ishonchliligini tekshirish uchun o'n marta o'zaro tekshirish qo'llanildi.O'zgaruvchilarni tanlash va parametrlarni tartibga solish l24 parametri bilan ehtimollikni maksimallashtirish jazosi bilan o'rnatiladi.Diskriminant modelining tasniflash samaradorligini tekshirish uchun global metabolomik tahlil ichki tekshirish (n = 104) va tashqi tekshirish (n = 111) guruhlarida mustaqil ravishda amalga oshirildi.Natijada, kashfiyot to'plamidagi 27 ta metabolit eng katta o'rtacha AUC qiymatiga ega bo'lgan eng yaxshi diskriminant modeli sifatida aniqlandi (2b-rasm), ular orasida 9 tasi faollikni oshirdi va LAda BN bilan solishtirganda 18 ta faollikni pasaytirdi (2c-rasm).
O'pka tugunlari tasniflagichini yaratish bo'yicha ish jarayoni, shu jumladan kashfiyotlar to'plamidagi sarum metabolitlarining eng yaxshi panelini ikkilik logistik regressiya modelidan foydalangan holda o'n marta o'zaro tekshirish orqali tanlash va ichki va tashqi tekshirish to'plamlarida prognozli ishlashni baholash.b Metabolik biomarker tanlash uchun LASSO regressiya modelining o'zaro tekshirish statistikasi.Yuqorida keltirilgan raqamlar ma'lum bir l da tanlangan biomarkerlarning o'rtacha sonini ko'rsatadi.Qizil nuqta chiziq mos keladigan lambdadagi o'rtacha AUC qiymatini ifodalaydi.Kulrang xato chiziqlari minimal va maksimal AUC qiymatlarini ifodalaydi.Nuqtali chiziq 27 tanlangan biomarker bilan eng yaxshi modelni bildiradi.AUC, qabul qiluvchining ishlash xarakteristikasi (ROC) egri chizig'i ostidagi maydon.c kashfiyot guruhidagi BN guruhi bilan solishtirganda LA guruhidagi 27 tanlangan metabolitning o'zgarishlarini katlayın.Qizil ustun - faollashtirish.Moviy ustun - pasayish.d–f Qabul qiluvchining ishlash xarakteristikasi (ROC) egri chiziqlari kashfiyot, ichki va tashqi tekshirish to'plamlarida 27 ta metabolit birikmalariga asoslangan diskriminant modelining kuchini ko'rsatadi.Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
Ushbu 27 ta metabolitning vaznli regressiya koeffitsientlari asosida bashorat qilish modeli yaratildi (qo'shimcha 3-jadval).Ushbu 27 metabolitga asoslangan ROC tahlili egri chizig'i ostidagi maydonni (AUC) 0,933 qiymatini, kashfiyot guruhining sezgirligi 0,868 va o'ziga xosligi 0,859 edi (2d-rasm).Shu bilan birga, LA va HC o'rtasidagi 38 ta izohli differentsial metabolitlar orasida 16 ta metabolitlar to'plami LA ni HC dan farqlashda 0,801 sezgirlik va 0,856 o'ziga xoslik bilan 0,902 AUC ga erishdi (Qo'shimcha rasm 6a-c).Differensial metabolitlar uchun turli qatlam o'zgarishlar chegaralariga asoslangan AUC qiymatlari ham taqqoslandi.Biz tasniflash modeli LA va BN (HC) o'rtasidagi farqni aniqlashda eng yaxshi natijaga erishganini aniqladik, qachonki qatlam o'zgarishi darajasi 1,2 ga nisbatan 1,5 yoki 2,0 ga o'rnatilgan (Qo'shimcha rasm 7a, b).27 ta metabolit guruhiga asoslangan tasniflash modeli ichki va tashqi kogortalarda qo'shimcha tasdiqlandi.AUC ichki tekshirish uchun 0,915 (sezuvchanlik 0,867, o'ziga xoslik 0,811) va tashqi tekshirish uchun 0,945 (sezuvchanlik 0,810, o'ziga xoslik 0,979) edi (2e, f-rasm).Laboratoriyalararo samaradorlikni baholash uchun "Usullar" bo'limida tavsiflanganidek, tashqi kogortadan 40 ta namuna tashqi laboratoriyada tahlil qilindi.Tasniflash aniqligi AUC 0,925 ga erishdi (qo'shimcha 8-rasm).O'pkaning skuamoz hujayrali karsinomasi (LUSC) o'pka adenokarsinomasidan (LUAD) keyin kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratoni (NSCLC) ning ikkinchi eng keng tarqalgan kichik turi bo'lganligi sababli, biz metabolik profillarning tasdiqlangan potentsial foydaliligini ham sinab ko'rdik.BN va LUSCning 16 ta holati.LUSC va BN o'rtasidagi diskriminatsiyaning AUC ko'rsatkichi 0,776 ni tashkil etdi (9-qo'shimcha rasm), bu LUAD va BN o'rtasidagi kamsitish bilan solishtirganda zaifroq qobiliyatni ko'rsatadi.
Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, KT tasvirlaridagi tugunlarning o'lchami malignite ehtimoli bilan ijobiy bog'liq va tugunlarni davolashning asosiy hal qiluvchi omili bo'lib qolmoqda25,26,27.NELSON skrining tadqiqotining katta guruhidan olingan ma'lumotlarning tahlili shuni ko'rsatdiki, tugunlari <5 mm bo'lgan sub'ektlarda malignite xavfi hatto tugunlari 28 bo'lmagan sub'ektlarga o'xshash edi.Shuning uchun, muntazam KT monitoringini talab qiladigan minimal o'lcham Britaniya Toraks Jamiyati (BTS) tomonidan tavsiya etilganidek 5 mm va Fleischner Jamiyati 29 tomonidan tavsiya etilganidek 6 mm.Shu bilan birga, 6 mm dan katta va noaniq o'pka tugunlari (IPN) deb ataladigan aniq yaxshi xususiyatlarga ega bo'lmagan tugunlar klinik amaliyotda baholash va boshqarishda asosiy muammo bo'lib qolmoqda30,31.Keyinchalik, kashfiyot va ichki tekshirish kogortalaridan yig'ilgan namunalar yordamida tugun o'lchami metabolomik imzolarga ta'sir qildimi yoki yo'qligini tekshirdik.27 tasdiqlangan biomarkerlarga e'tibor qaratib, biz birinchi navbatda HC va BN sub-6 mm metabolomlarining PCA profillarini solishtirdik.Biz HC va BN uchun ma'lumotlar nuqtalarining aksariyati bir-biriga mos kelishini aniqladik, bu esa sarum metabolitlari darajalari ikkala guruhda ham o'xshashligini ko'rsatdi (3a-rasm).Turli xil o'lchamdagi diapazondagi xususiyat xaritalari BN va LA (3b-rasm, c) da saqlanib qoldi, holbuki 6-20 mm diapazonda malign va benign tugunlar o'rtasida ajralish kuzatildi (3d-rasm).Ushbu kohort 6 dan 20 mm gacha bo'lgan nodullarning malignligini bashorat qilish uchun AUC 0,927, o'ziga xoslik 0,868 va sezuvchanlik 0,820 ga ega edi (3e, f-rasm).Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, klassifikator tugun hajmidan qat'i nazar, erta malign transformatsiyalar natijasida yuzaga kelgan metabolik o'zgarishlarni ushlay oladi.
27 ta metabolitning metabolik tasniflagichi asosida belgilangan guruhlar o'rtasida PCA profillarini taqqoslash.CC va BN < 6 mm.b BN < 6 mm va BN 6-20 mm.LA da 6–20 mm, LA 20–30 mm.g BN 6-20 mm va LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Qabul qiluvchining ishlash xarakteristikasi (ROC) egri chizig'i 6–20 mm nodullar uchun diskriminant model ishlashini ko'rsatadi.f Ehtimollik qiymatlari 6-20 mm o'lchamdagi tugunlar uchun logistik regressiya modeli asosida hisoblab chiqilgan.Kulrang nuqtali chiziq optimal kesish qiymatini (0,455) ifodalaydi.Yuqoridagi raqamlar Los-Anjeles uchun prognoz qilingan ishlarning foizini ko'rsatadi.Ikki dumli Student t testidan foydalaning.PCA, asosiy komponent tahlili.Egri chiziq ostidagi AUC maydoni.Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
O'pka tugunlarining o'lchamiga o'xshash (7-9 mm) bo'lgan to'rtta namuna (44-61 yosh) taklif qilingan malignite prognozi modelining ishlashini ko'rsatish uchun tanlangan (4a, b-rasm).Dastlabki skriningda 1-holati ohaklangan qattiq tugun sifatida namoyon bo'ldi, bu yaxshilik bilan bog'liq, 2-holda esa noaniq qisman qattiq tugun sifatida, yaqqol yaxshi belgilari yo'q.Kuzatuv kompyuter tomografiyasining uch bosqichi bu holatlar 4 yil davomida barqaror bo'lib qolganligini va shuning uchun yaxshi tugunlar deb hisoblanganligini ko'rsatdi (4a-rasm).Seriyali kompyuter tomografiyasini klinik baholash bilan solishtirganda, joriy tasniflagich modeli bilan bir martalik sarum metabolitini tahlil qilish ehtimollik cheklovlari asosida ushbu yaxshi tugunlarni tez va to'g'ri aniqladi (1-jadval).3-holatdagi 4b-rasmda plevral retraktsiya belgilari bo'lgan tugun ko'rsatilgan, bu ko'pincha malignite bilan bog'liq32.4-holati noaniq qisman qattiq tugun sifatida ko'rsatilgan bo'lib, hech qanday yaxshi sabab yo'q.Ushbu holatlarning barchasi klassifikator modeliga ko'ra malign deb taxmin qilingan (1-jadval).O'pka adenokarsinomasini baholash o'pka rezektsiyasi operatsiyasidan keyin gistopatologik tekshiruv orqali ko'rsatildi (4b-rasm).Tashqi tekshirish to'plami uchun metabolik tasniflagich 6 mm dan katta noaniq o'pka tugunlarining ikkita holatini aniq bashorat qildi (qo'shimcha 10-rasm).
Ikkita benign tugunning o'pkasining eksenel oynasining KT tasvirlari.1-holatda, 4 yildan keyin kompyuter tomografiyasi o'ng pastki lobda kalsifikatsiya bilan 7 mm o'lchamdagi barqaror qattiq tugunni ko'rsatdi.2-holatda 5 yildan so'ng kompyuter tomografiyasi o'ng yuqori lobda diametri 7 mm bo'lgan barqaror, qisman qattiq tugunni aniqladi.b O'pkaning eksenel oynasi KT tasvirlari va o'pka rezektsiyasidan oldin I bosqich adenokarsinomasining ikkita holatining tegishli patologik tadqiqotlari.3-holatda o'ng yuqori bo'lakda diametri 8 mm bo'lgan plevra tortilishi bilan tugun aniqlangan.4-holatda chap yuqori lobda 9 mm o'lchamdagi qisman qattiq shishasimon nodul aniqlangan.Rezektsiya qilingan o'pka to'qimalarining gematoksilin va eozin (H&E) bo'yalishi (shkala bar = 50 mkm) o'pka adenokarsinomasining asinar o'sish naqshini ko'rsatadi.Oklar KT tasvirlarida aniqlangan tugunlarni ko'rsatadi.H&E tasvirlari patolog tomonidan tekshirilgan bir nechta (>3) mikroskopik maydonlarning vakili tasvirlari.
Birgalikda olingan natijalar o'pka tugunlarining differentsial tashxisida sarum metabolitlari biomarkerlarining potentsial qiymatini ko'rsatadi, bu esa KT skriningini baholashda qiyinchiliklarga olib kelishi mumkin.
Tasdiqlangan differentsial metabolitlar paneliga asoslanib, biz asosiy metabolik o'zgarishlarning biologik korrelyatsiyasini aniqlashga harakat qildik.MetaboAnalyst tomonidan KEGG yo'lini boyitish tahlili ikkita berilgan guruh o'rtasida 6 ta umumiy sezilarli darajada o'zgartirilgan yo'llarni aniqladi (LA va HC va LA va BN, sozlangan p ≤ 0,001, ta'sir > 0,01).Bu o'zgarishlar piruvat almashinuvi, triptofan almashinuvi, niatsin va nikotinamid metabolizmi, glikoliz, TCA sikli va purin almashinuvidagi buzilishlar bilan tavsiflangan (5a-rasm).Keyinchalik mutlaq miqdoriy aniqlash yordamida katta o'zgarishlarni tekshirish uchun maqsadli metabolomikani amalga oshirdik.Haqiqiy metabolit standartlari yordamida uch karra to'rt kutupli massa spektrometriyasi (QQQ) orqali tez-tez o'zgartirilgan yo'llarda umumiy metabolitlarni aniqlash.Metabolomikani o'rganish bo'yicha maqsadli namunaning demografik xususiyatlari qo'shimcha 4-jadvalga kiritilgan. Bizning global metabolomik natijalarimizga muvofiq, miqdoriy tahlil LAda hipoksantin va ksantin, piruvat va laktat BN va HC ga nisbatan ko'payganligini tasdiqladi (5b, s-rasm). p <0,05).Biroq, bu metabolitlarda BN va HC o'rtasida sezilarli farqlar topilmadi.
BN va HC guruhlariga nisbatan LA guruhidagi sezilarli darajada farq qiluvchi metabolitlarning KEGG yo'lini boyitish tahlili.Ikki dumli Globaltest ishlatildi va p qiymatlari Holm-Bonferroni usuli yordamida o'rnatildi (sozlangan p ≤ 0,001 va effekt hajmi> 0,01).b-d LC-MS/MS tomonidan aniqlangan HC, BN va LA zardobidagi hipoksantin, ksantin, laktat, piruvat va triptofan darajasini ko'rsatadigan skripka chizmalari (guruh uchun n = 70).Oq va qora nuqtali chiziqlar mos ravishda mediana va kvartilni bildiradi.e LUAD-TCGA ma'lumotlar to'plamidagi normal o'pka to'qimalariga (n = 59) nisbatan o'pka adenokarsinomasida (n = 513) SLC7A5 va QPRTning normallashtirilgan Log2TPM (millionga transkript) mRNK ifodasini ko'rsatadigan skripka syujeti.Oq quti kvartillararo diapazonni, markazdagi gorizontal qora chiziq medianani va qutidan cho'zilgan vertikal qora chiziq 95% ishonch oralig'ini (CI) ifodalaydi.f TCGA ma'lumotlar to'plamida o'pka adenokarsinomasida (n = 513) va normal o'pka to'qimalarida (n = 59) SLC7A5 va GAPDH ifodasining Pearson korrelyatsiya grafigi.Kulrang maydon 95% CI ni ifodalaydi.r, Pearson korrelyatsiya koeffitsienti.g LC-MS/MS tomonidan aniqlangan nonspesifik shRNK nazorati (NC) va shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilan transfektsiyalangan A549 hujayralarida normallashtirilgan hujayra triptofan darajalari.Har bir guruhdagi beshta biologik mustaqil namunalarning statistik tahlili keltirilgan.h A549 hujayralarida (NC) va SLC7A5 ishdan chiqqan A549 hujayralarida (Sh1, Sh2) NADt (jami NAD, shu jumladan NAD+ va NADH) ning hujayra darajasi.Har bir guruhdagi uchta biologik mustaqil namunalarning statistik tahlili keltirilgan.i A549 hujayralarining SLC7A5 ishdan chiqishidan oldin va keyin glikolitik faolligi hujayradan tashqari kislotalanish darajasi (ECAR) bilan o'lchandi (har bir guruh uchun n = 4 biologik mustaqil namuna).2-DG,2-deoksi-D-glyukoza.Ikki dumli Student's t testi (b-h) da ishlatilgan.(g-i) da xato chiziqlari o'rtacha ± SD ni ifodalaydi, har bir tajriba mustaqil ravishda uch marta o'tkazildi va natijalar o'xshash edi.Manba ma'lumotlari manba ma'lumotlar fayllari shaklida taqdim etiladi.
LA guruhidagi o'zgartirilgan triptofan metabolizmining sezilarli ta'sirini hisobga olgan holda, biz QQQ yordamida HC, BN va LA guruhlarida sarum triptofan darajasini ham baholadik.Biz qon zardobida triptofan miqdori HC yoki BN bilan solishtirganda kamayganligini aniqladik (p <0,001, 5d-rasm), bu o'pka saratoni bilan og'rigan bemorlarda aylanma triptofan darajalari nazorat guruhidagi sog'lom odamlarga qaraganda pastroq ekanligi haqidagi oldingi ma'lumotlarga mos keladi33,34 ,35.PET/KT kuzatuvchisi 11C-metil-L-triptofandan foydalangan holda o'tkazilgan yana bir tadqiqot shuni ko'rsatdiki, o'pka saratoni to'qimalarida triptofan signalini ushlab turish vaqti yaxshi shikastlanishlar yoki oddiy to'qimalarga nisbatan sezilarli darajada oshgan36.Biz faraz qilamizki, LA zardobidagi triptofanning kamayishi o'pka saratoni hujayralari tomonidan faol triptofan o'zlashtirilishini aks ettirishi mumkin.
Shuningdek, triptofan katabolizmining kinurenin yo'lining yakuniy mahsuloti NAD+37,38 bo'lib, glikolizda glitseraldegid-3-fosfatning 1,3-bifosfogliserat bilan reaksiyasi uchun muhim substrat bo'lishi ma'lum39.Oldingi tadqiqotlar immunitetni tartibga solishda triptofan katabolizmining roliga qaratilgan bo'lsa-da, biz joriy tadqiqotda kuzatilgan triptofan disregulyatsiyasi va glikolitik yo'llar o'rtasidagi o'zaro bog'liqlikni tushuntirishga harakat qildik.Eritma tashuvchisi oilasining 7 a'zosi 5 (SLC7A5) triptofan tashuvchisi ekanligi ma'lum43,44,45.Xinolin kislotasi fosforiboziltransferaza (QPRT) kinolin kislotasini NAMN46 ga aylantiradigan kinurenin yo'lining quyi oqimida joylashgan fermentdir.LUAD TCGA ma'lumotlar to'plamini tekshirish SLC7A5 va QPRT ham normal to'qimalarga nisbatan o'simta to'qimalarida sezilarli darajada yuqori tartibga solinganligini ko'rsatdi (5e-rasm).Ushbu o'sish o'pka adenokarsinomasining I va II bosqichlarida, shuningdek III va IV bosqichlarida kuzatildi (qo'shimcha 11-rasm), bu o'simta hosil bo'lishi bilan bog'liq triptofan metabolizmidagi erta buzilishlarni ko'rsatadi.
Bundan tashqari, LUAD-TCGA ma'lumotlar to'plami saraton kasali namunalarida SLC7A5 va GAPDH mRNK ifodasi o'rtasida ijobiy korrelyatsiyani ko'rsatdi (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f-rasm).Aksincha, oddiy o'pka to'qimalarida bunday gen imzolari o'rtasida sezilarli korrelyatsiya topilmadi (r = 0,25, p = 0,06, 5f-rasm).A549 hujayralarida SLC7A5 (qo'shimcha 12-rasm) ishdan chiqishi hujayradagi triptofan va NAD(H) darajasini sezilarli darajada pasaytirdi (5g,h-rasm), bu hujayradan tashqari kislotalanish darajasi (ECAR) bilan o'lchanadigan glikolitik faollikni susaytirdi (1-rasm).5i).Shunday qilib, sarumdagi metabolik o'zgarishlar va in vitro aniqlashga asoslanib, biz triptofan metabolizmi kinurenin yo'li orqali NAD + ishlab chiqarishi va o'pka saratonida glikolizni rag'batlantirishda muhim rol o'ynashi mumkin deb taxmin qilamiz.
Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, LDCT tomonidan aniqlangan ko'p sonli noaniq o'pka tugunlari noto'g'ri ijobiy tashxis tufayli PET-KT, o'pka biopsiyasi va haddan tashqari davolash kabi qo'shimcha tekshiruvlarga ehtiyoj tug'dirishi mumkin.31 6-rasmda ko'rsatilganidek, bizning tadqiqotimiz potentsial diagnostik qiymatga ega bo'lgan sarum metabolitlari panelini aniqladi, bu esa KT tomonidan aniqlangan o'pka tugunlarining xavf tabaqalanishini va keyingi boshqaruvini yaxshilashi mumkin.
O'pka nodullari past dozali kompyuter tomografiyasi (LDCT) yordamida yaxshi yoki yomon xulqli sabablarni ko'rsatadigan ko'rish xususiyatlari bilan baholanadi.Nodullarning noaniq natijasi tez-tez kuzatuv tashriflariga, keraksiz aralashuvlarga va ortiqcha davolanishga olib kelishi mumkin.Diagnostik ahamiyatga ega bo'lgan qon zardobidagi metabolik tasniflagichlarni kiritish xavfni baholashni va o'pka tugunlarini keyingi boshqarishni yaxshilashi mumkin.PET pozitron emissiya tomografiyasi.
AQSh NLST tadqiqoti va Yevropa NELSON tadqiqoti ma'lumotlari shuni ko'rsatadiki, past dozali kompyuter tomografiyasi (LDCT) bilan yuqori xavfli guruhlarni skrining o'pka saratoni o'limini kamaytirishi mumkin1,3.Shu bilan birga, LDCT tomonidan aniqlangan ko'p sonli tasodifiy o'pka tugunlarining xavfini baholash va keyinchalik klinik davolash eng qiyin bo'lib qolmoqda.Asosiy maqsad ishonchli biomarkerlarni o'z ichiga olgan holda mavjud LDCT asosidagi protokollarni to'g'ri tasniflashni optimallashtirishdir.
Qon metabolitlari kabi ba'zi molekulyar biomarkerlar o'pka saratonini sog'lom nazorat bilan solishtirish orqali aniqlangan15,17.Joriy tadqiqotda biz LDCT tomonidan tasodifan aniqlangan benign va malign o'pka tugunlarini ajratish uchun sarum metabolomik tahlilini qo'llashga e'tibor qaratdik.Biz UPLC-HRMS tahlilidan foydalangan holda sog'lom nazorat (HC), yaxshi o'pka nodullari (BN) va I bosqichdagi o'pka adenokarsinomasi (LA) namunalarining global sarum metabolomini solishtirdik.Biz HC va BN ning o'xshash metabolik profilga ega ekanligini aniqladik, LA esa HC va BN bilan solishtirganda sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi.LA ni HC va BN dan ajratib turadigan ikkita sarum metabolitlari to'plamini aniqladik.
LDCT asosidagi joriy benign va malign tugunlarni aniqlash sxemasi asosan tugunlarning hajmi, zichligi, morfologiyasi va vaqt o'tishi bilan o'sish tezligiga asoslanadi30.Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, tugunlarning kattaligi o'pka saratoni ehtimoli bilan chambarchas bog'liq.Hatto yuqori xavfli bemorlarda ham, <6 mm tugunlarda malign o'sma xavfi <1% ni tashkil qiladi.6 dan 20 mm gacha bo'lgan tugunlar uchun xavfli o'sish xavfi 8% dan 64% gacha30.Shuning uchun Fleischner jamiyati KTni muntazam kuzatish uchun 6 mm diametrli kesishni tavsiya qiladi.29 Biroq, 6 mm dan katta noaniq o'pka tugunlari (IPN) xavfini baholash va boshqarish etarli darajada bajarilmagan 31 .Tug'ma yurak kasalliklarini hozirgi davolash odatda kompyuter tomografiyasini tez-tez kuzatish bilan ehtiyotkor kutishga asoslanadi.
Tasdiqlangan metabolomga asoslanib, biz birinchi marta sog'lom odamlar va <6 mm bo'lgan benign tugunlar o'rtasidagi metabolomik belgilarning bir-biriga mos kelishini ko'rsatdik.Biologik o'xshashlik KT tekshiruvi natijalariga ko'ra, 6 mm dan past tugunlar uchun xavfli tugunlari bo'lmagan sub'ektlardagi kabi past bo'ladi.30 Shuni ta'kidlash kerakki, bizning natijalarimiz shuningdek, <6 mm va ≥6 mm bo'lgan benign tugunlar yuqori ekanligini ko'rsatadi. metabolomik profillardagi o'xshashlik, benign etiologiyaning funktsional ta'rifi tugun hajmidan qat'iy nazar izchil ekanligini ko'rsatadi.Shunday qilib, zamonaviy diagnostik sarum metabolitlari panellari KT da nodullar dastlab aniqlanganda va potentsial ravishda ketma-ket monitoringni kamaytirishda istisno sinovi sifatida bitta tahlilni taqdim etishi mumkin.Shu bilan birga, metabolik biomarkerlarning bir xil paneli o'lchami ≥6 mm bo'lgan malign tugunlarni yaxshi tugunlardan ajratdi va KT tasvirlarida o'xshash o'lchamdagi IPN va noaniq morfologik xususiyatlar uchun aniq prognozlarni taqdim etdi.Sarum metabolizmining ushbu tasniflagichi AUC 0,927 bo'lgan ≥6 mm tugunlarning malignligini bashorat qilishda yaxshi natijalarga erishdi.Birgalikda olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, qon zardobidagi noyob metabolomik belgilar ayniqsa o'simtadan kelib chiqqan metabolik o'zgarishlarni aks ettirishi va tugun hajmidan qat'i nazar, xavf prognozi sifatida potentsial ahamiyatga ega bo'lishi mumkin.
Shunisi e'tiborga loyiqki, o'pka adenokarsinomasi (LUAD) va skuamoz hujayrali karsinoma (LUSC) kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratoni (NSCLC) ning asosiy turlari hisoblanadi.LUSC tamaki iste'moli bilan chambarchas bog'liqligini hisobga olib47 va LUAD KT skriningida aniqlangan tasodifiy o'pka tugunlarining eng keng tarqalgan gistologiyasi48, bizning tasniflash modelimiz adenokarsinomaning I bosqichi namunalari uchun maxsus ishlab chiqilgan.Vang va uning hamkasblari, shuningdek, LUADga e'tibor qaratdilar va erta bosqichdagi o'pka saratonini sog'lom odamlardan ajratish uchun lipidomika yordamida to'qqizta lipid belgisini aniqladilar17.Biz joriy klassifikator modelini 16 ta LUSC bosqichi va 74 ta yaxshi tugunlarda sinab ko'rdik va past LUSC bashorat qilish aniqligini (AUC 0,776) kuzatdik, bu LUAD va LUSC ning o'z metabolomik imzolariga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi.Haqiqatan ham, LUAD va LUSC etiologiyasi, biologik kelib chiqishi va genetik aberratsiyasida farqlanishi ko'rsatilgan49.Shuning uchun skrining dasturlarida o'pka saratonini populyatsiyaga asoslangan aniqlash bo'yicha o'quv modellariga gistologiyaning boshqa turlari kiritilishi kerak.
Bu erda biz sog'lom nazorat va yaxshi tugunlar bilan solishtirganda o'pka adenokarsinomasida eng tez-tez o'zgargan oltita yo'lni aniqladik.Ksantin va gipoksantin purin almashinuvining umumiy metabolitlaridir.Bizning natijalarimizga muvofiq, o'pka adenokarsinomasi bo'lgan bemorlarning zardobida yoki to'qimalarida purin almashinuvi bilan bog'liq oraliq mahsulotlar sog'lom nazorat yoki invaziv bosqichdagi bemorlarga nisbatan sezilarli darajada oshdi15,50.Sarumdagi ksantin va gipoksantin darajalarining ko'tarilishi saraton hujayralarining tez ko'payishi uchun zarur bo'lgan anabolizmni aks ettirishi mumkin.Glyukoza almashinuvining buzilishi saraton metabolizmining taniqli belgisidir51.Bu erda biz HC va BN guruhiga nisbatan LA guruhida piruvat va laktatning sezilarli o'sishini kuzatdik, bu kichik hujayrali bo'lmagan o'pka saratoni (NSCLC) bemorlarining sarum metabolom profilidagi glikolitik yo'l anormalliklari haqidagi oldingi hisobotlarga mos keladi. sog'lom nazorat.natijalar izchil 52,53.
Muhimi, biz o'pka adenokarsinomalari zardobida piruvat va triptofan almashinuvi o'rtasidagi teskari korrelyatsiyani kuzatdik.Sarum triptofan darajasi HC yoki BN guruhiga nisbatan LA guruhida kamaydi.Qizig'i shundaki, istiqbolli kohortdan foydalangan holda oldingi keng miqyosli tadqiqot, aylanib yuruvchi triptofanning past darajalari o'pka saratoni 54 xavfi ortishi bilan bog'liqligini aniqladi.Triptofan biz butunlay oziq-ovqatdan oladigan muhim aminokislotadir.O'pka adenokarsinomasida zardobdagi triptofanning kamayishi ushbu metabolitning tez sur'atda yo'qolishini aks ettirishi mumkin degan xulosaga keldik.Ma'lumki, kinurenin yo'li orqali triptofan katabolizmining yakuniy mahsuloti de novo NAD + sintezining manbai hisoblanadi.NAD+ asosan qutqaruv yoʻli orqali hosil boʻlganligi sababli, NAD+ ning triptofan almashinuvidagi ahamiyati salomatlik va kasalliklarda aniqlanishi kerak46.TCGA ma'lumotlar bazasini tahlil qilishimiz shuni ko'rsatdiki, 7A5 (SLC7A5) triptofan tashuvchisi erituvchi tashuvchining ifodasi oddiy nazorat bilan solishtirganda o'pka adenokarsinomasida sezilarli darajada oshgan va GAPDH glikolitik fermenti ifodasi bilan ijobiy bog'liqdir.Oldingi tadqiqotlar asosan triptofan katabolizmining antitumor immun javobini bostirishdagi roliga qaratilgan edi40,41,42.Bu erda biz o'pka saratoni hujayralarida SLC7A5 ni sindirish orqali triptofanning so'rilishini inhibe qilish hujayralardagi NAD darajasining keyingi pasayishiga va glikolitik faollikning bir vaqtning o'zida susayishiga olib kelishini ko'rsatamiz.Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz o'pka adenokarsinomasining malign transformatsiyasi bilan bog'liq bo'lgan sarum metabolizmidagi o'zgarishlar uchun biologik asos yaratadi.
EGFR mutatsiyalari NSCLC bilan og'rigan bemorlarda eng keng tarqalgan haydovchi mutatsiyalardir.Tadqiqotimizda biz EGFR mutatsiyasiga ega bo'lgan bemorlarda (n = 41) yovvoyi tipdagi EGFR (n = 31) bilan og'rigan bemorlarga o'xshash umumiy metabolomik profilga ega ekanligini aniqladik, garchi biz asilkarnitinli bemorlarda ba'zi EGFR mutant bemorlarining sarum darajasining pasayishini aniqladik.Asilkarnitinlarning belgilangan vazifasi sitoplazmadan mitoxondriyal matritsaga atsil guruhlarini tashishdan iborat bo'lib, energiya ishlab chiqarish uchun yog' kislotalarining oksidlanishiga olib keladi 55 .Bizning topilmalarimizga muvofiq, yaqinda o'tkazilgan tadqiqot 102 ta o'pka adenokarsinoma to'qimalari namunalarining global metabolomini tahlil qilish orqali EGFR mutant va EGFR yovvoyi turdagi o'smalar o'rtasidagi o'xshash metabolom profillarini ham aniqladi50.Qizig'i shundaki, asilkarnitin tarkibi EGFR mutant guruhida ham topilgan.Shu sababli, asilkarnitin darajasidagi o'zgarishlar EGFR tomonidan qo'zg'atilgan metabolik o'zgarishlarni aks ettiradimi yoki yo'qmi va uning asosiy molekulyar yo'llari qo'shimcha o'rganishga loyiq bo'lishi mumkin.
Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz o'pka tugunlarining differentsial diagnostikasi uchun sarum metabolik klassifikatorini o'rnatadi va KT skriningi asosida xavfni baholashni optimallashtirish va klinik boshqaruvni osonlashtiradigan ish oqimini taklif qiladi.
Ushbu tadqiqot Sun Yat-sen universiteti saraton kasalxonasining axloqiy qo'mitasi, Sun Yat-sen universitetining birinchi filiali kasalxonasi va Zhengzhou universiteti saraton kasalxonasining axloq qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.Kashf qilish va ichki tekshirish guruhlarida sog'lom odamlardan 174 ta sara va yaxshi tugunlardan 244 ta sara, Sun Yat-sen universiteti saraton markazi saraton kasalligini nazorat qilish va oldini olish bo'limida yillik tibbiy ko'rikdan o'tadigan shaxslardan va 166 ta yaxshi tugunlardan to'plangan.sarum.I bosqichdagi o'pka adenokarsinomalari Sun Yat-sen universiteti saraton markazidan to'plangan.Tashqi tekshirish kohortida yaxshi tugunlarning 48 ta holati, Sun Yat-sen universitetining birinchi kasalxonasidan I bosqich o'pka adenokarsinomasining 39 ta holati va Zhenchjou saraton kasalxonasidan I bosqich o'pka adenokarsinomasining 24 ta holati mavjud.Sun Yat-sen universiteti saraton markazi, shuningdek, o'rnatilgan metabolik klassifikatorning diagnostika qobiliyatini tekshirish uchun I bosqichdagi skuamoz hujayrali o'pka saratonining 16 ta holatini to'pladi (bemorning xususiyatlari qo'shimcha 5-jadvalda ko'rsatilgan).Kashfiyot kohorti va ichki tekshirish kogortasidan namunalar 2018-yilning yanvaridan 2020-yilning mayigacha toʻplangan. Tashqi tekshirish kohortasi uchun namunalar 2021-yil avgustidan 2022-yilning oktyabrigacha toʻplangan. Gender tarafkashliklarini minimallashtirish uchun har biriga taxminan teng miqdordagi erkak va ayol holatlari tayinlangan. kogorta.Kashfiyot guruhi va ichki ko'rib chiqish guruhi.Ishtirokchining jinsi o'z-o'zidan hisobot asosida aniqlandi.Barcha ishtirokchilardan xabardor qilingan rozilik olindi va hech qanday kompensatsiya berilmadi.Yaxshi tugunlari bo'lgan sub'ektlar, operatsiyadan oldin to'plangan va gistopatologiya tomonidan tashxis qo'yilgan tashqi tekshirish namunasidan 1 holat bundan mustasno, tahlil vaqtida 2-5 yil ichida barqaror KT ko'rsatkichiga ega bo'lganlar edi.Surunkali bronxit bundan mustasno.O'pka adenokarsinomasi holatlari o'pka rezektsiyasidan oldin to'plangan va patologik tashxis bilan tasdiqlangan.Ro'za qon namunalari hech qanday antikoagulyantlarsiz sarum ajratish naychalarida to'plangan.Qon namunalari xona haroratida 1 soat davomida pıhtılaştırıldı va keyin sarum supernatantini to'plash uchun 4 ° C da 10 daqiqa davomida 2851 × g da santrifüj qilindi.Sarum alikvotlari metabolit ekstraktsiyasigacha -80 ° C da muzlatilgan.Sun Yat-sen universiteti saraton markazining saraton profilaktikasi va tibbiy ko'rikdan o'tkazish bo'limi 100 ta sog'lom donorlardan, shu jumladan 40 yoshdan 55 yoshgacha bo'lgan teng miqdordagi erkaklar va ayollardan sarum to'pladi.Har bir donor namunasining teng hajmlari aralashtiriladi, hosil bo'lgan hovuz ajratiladi va -80 ° C da saqlanadi.Sarum aralashmasi sifat nazorati va ma'lumotlarni standartlashtirish uchun mos yozuvlar materiali sifatida ishlatilgan.
Yo'naltiruvchi sarum va sinov namunalari eritildi va metabolitlar birlashtirilgan ekstraksiya usuli (MTBE / metanol / suv) 56 yordamida ekstraksiya qilindi.Qisqacha aytganda, 50 mkl sarum 225 mkl muzli sovuq metanol va 750 mkl muzdek sovuq metil tert-butil efir (MTBE) bilan aralashtirildi.Aralashmani aralashtiring va muzda 1 soat davomida inkubatsiya qiling.Keyin namunalar aralashtirildi va vorteks bilan ichki standartlarga ega bo'lgan MS sinfidagi 188 mkl suv bilan aralashtirildi (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin va 13C6-izoleysin, Kembrij Isotope Laboratoriesdan sotib olingan).Keyin aralash 15 000 × g da 4 ° C da 10 daqiqa davomida santrifüj qilindi va pastki faza ijobiy va salbiy rejimlarda LC-MS tahlili uchun ikkita naychaga (har biri 125 mL) o'tkazildi.Nihoyat, namuna yuqori tezlikda ishlaydigan vakuumli kontsentratorda quruq bo'lgunga qadar bug'landi.
Quritilgan metabolitlar 120 mkl 80% asetonitrilda qayta tiklandi, 5 daqiqa davomida vortekslanadi va 4 ° C da 10 daqiqa davomida 15000 × g da santrifüj qilindi.Supernatantlar metabolomikani o'rganish uchun mikroinsertli amber shisha flakonlarga o'tkazildi.Ultra samarali suyuqlik xromatografiyasi-yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (UPLC-HRMS) platformasida maqsadsiz metabolomik tahlil.Metabolitlar Dionex Ultimate 3000 UPLC tizimi va ACQUITY BEH Amid ustuni (2,1 × 100 mm, 1,7 mkm, Waters) yordamida ajratilgan.Ijobiy ion rejimida harakatlanuvchi fazalar 95% (A) va 50% asetonitril (B), har birida 10 mmol / L ammoniy asetat va 0,1% chumoli kislotasi mavjud.Salbiy rejimda A va B mobil fazalari mos ravishda 95% va 50% asetonitrilni o'z ichiga olgan, ikkala fazada 10 mmol / L ammoniy asetat mavjud, pH = 9. Gradient dasturi quyidagicha edi: 0-0,5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1-20 min, 2% B. Ustun 40 ° C da, namuna esa 10 ° C da avtomatik namunada saqlanadi.Oqim tezligi 0,3 ml/min, inyeksiya hajmi 3 mkl.Elektrosprey ionlash (ESI) manbaiga ega Q-Exactive Orbitrap massa spektrometri (Thermo Fisher Scientific) katta hajmdagi ma'lumotlarni to'plash uchun to'liq skanerlash rejimida va ddMS2 monitoring rejimi bilan birlashtirildi.MS parametrlari quyidagicha o'rnatildi: purkash kuchlanishi +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillyar harorati 320 ° C, himoya gaz 40 arb, yordamchi gaz 10 arb, zond isitgichi harorati 350 ° C, skanerlash diapazoni 70-1050 m / soat, rezolyutsiya.70 000. Ma'lumotlar Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) yordamida olingan.
Ma'lumotlar sifatini baholash uchun har bir namunadan supernatantning 10 mkl alikvotlarini olib tashlash orqali birlashtirilgan sifat nazorati (QC) namunalari yaratildi.UPLC-MS tizimining barqarorligini baholash uchun analitik ketma-ketlikning boshida oltita sifat nazorati namunasi inyeksiyasi tahlil qilindi.Keyinchalik sifat nazorati namunalari vaqti-vaqti bilan partiyaga kiritiladi.Ushbu tadqiqotda sarum namunalarining barcha 11 partiyasi LC-MS tomonidan tahlil qilindi.100 ta sog'lom donordan olingan sarum hovuz aralashmasining alikvotlari ekstraksiya jarayonini kuzatish va partiyadan partiyaga ta'sirni sozlash uchun tegishli partiyalarda mos yozuvlar materiali sifatida ishlatilgan.Sun Yat-sen universitetining Metabolomika markazida kashfiyot kohorti, ichki tekshirish kohorti va tashqi tekshirish kohortasining maqsadsiz metabolomik tahlili o'tkazildi.Guangdong Texnologiyalar Universitetining tahlil va sinov markazining tashqi laboratoriyasi, shuningdek, tasniflagich modelining ishlashini tekshirish uchun tashqi kogortadan 40 ta namunani tahlil qildi.
Ekstraksiya va qayta tiklashdan so'ng sarum metabolitlarining mutlaq miqdori bir nechta reaktsiya monitoringi (MRM) rejimida elektrosprey ionlash (ESI) manbai bilan ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiya-tandem massa spektrometriyasi (Agilent 6495 uch tomonlama to'rt kutupli) yordamida o'lchandi.Metabolitlarni ajratish uchun ACQUITY BEH amid ustuni (2,1 × 100 mm, 1,7 mkm, Waters) ishlatilgan.Mobil faza 90% (A) va 5% asetonitrildan (B) 10 mmol / L ammoniy asetat va 0,1% ammiak eritmasidan iborat edi.Gradient dasturi quyidagicha edi: 0-1,5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.Ustun 40 °C da, namuna esa 10 °C da avtonamunalagichda saqlangan.Oqim tezligi 0,3 ml/min, inyeksiya hajmi esa 1 mkL edi.MS parametrlari quyidagicha o'rnatildi: kapillyar kuchlanish ± 3,5 kV, nebulizer bosimi 35 psi, qobiq gazining oqimi 12 L / min, qobiq gazining harorati 350 ° C, quritish gazining harorati 250 ° C va quritish gazining oqimi 14 l / min.Triptofan, piruvat, laktat, gipoksantin va ksantinning MRM konversiyasi 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 va 151,0–107 ni tashkil etdi.mos ravishda 9.Ma'lumotlar Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) yordamida to'plangan.Sarum namunalari uchun triptofan, piruvat, laktat, gipoksantin va ksantin standart aralashma eritmalarining kalibrlash egri chiziqlari yordamida miqdori aniqlandi.Hujayra namunalari uchun triptofan tarkibi ichki standart va hujayra oqsili massasiga normallashtirildi.
Pik qazib olish (m/z va ushlab turish vaqti (RT)) Compound Discovery 3.1 va TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) yordamida amalga oshirildi.Partiyalar orasidagi potentsial farqlarni bartaraf qilish uchun sinov namunasining har bir xarakteristik cho'qqisi nisbiy mo'l-ko'llikni olish uchun bir xil partiyadagi mos yozuvlar materialining xarakterli cho'qqisiga bo'lingan.Standartlashtirishdan oldin va keyin ichki standartlarning nisbiy standart og'ishlari Qo'shimcha 6-jadvalda ko'rsatilgan. Ikki guruh o'rtasidagi farqlar noto'g'ri aniqlash tezligi (FDR<0,05, Wilcoxon tomonidan imzolangan daraja testi) va qatlam o'zgarishi (>1,2 yoki <0,83) bilan tavsiflanadi.Chiqarilgan xususiyatlarning xom MS ma'lumotlari va mos ravishda 1-qo'shimcha ma'lumotlar va 2-qo'shimcha ma'lumotlarda ko'rsatilgan.Tepalik izohi aniqlangan metabolitlar, taxminiy izohlangan birikmalar, taxminiy xarakterli birikma sinflari va noma'lum birikmalar 22, shu jumladan identifikatsiyaning to'rtta belgilangan darajasiga asoslangan holda amalga oshirildi.Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) da maʼlumotlar bazasini izlash asosida MS/MS tasdiqlangan standartlarga mos keladigan biologik birikmalar yoki mzCloud (bal > 85) yoki Chemspiderʼdagi aniq moslik izohlari nihoyat differentsial metabolom oʻrtasida oraliq mahsulot sifatida tanlandi.Har bir xususiyat uchun eng yuqori izohlar Qo'shimcha ma'lumotlar 3-ga kiritilgan. MetaboAnalyst 5.0 yig'indisi normallashtirilgan metabolitlar ko'pligini bir o'zgaruvchan tahlil qilish uchun ishlatilgan.MetaboAnalyst 5.0, shuningdek, sezilarli darajada farq qiluvchi metabolitlar asosida KEGG yo'lini boyitish tahlilini baholadi.Asosiy komponentlar tahlili (PCA) va qisman eng kichik kvadratlar diskriminant tahlili (PLS-DA) stekni normallashtirish va avtomatik o'lchov bilan ropls dasturiy paketi (v.1.26.4) yordamida tahlil qilindi.Tugunning malignligini bashorat qilish uchun optimal metabolit biomarker modeli eng kam mutlaq qisqarish va tanlash operatori (LASSO, R paketi v.4.1-3) bilan ikkilik logistik regressiya yordamida yaratilgan.Aniqlash va tekshirish to'plamlarida diskriminant modelining ishlashi pROC paketiga (v.1.18.0.) muvofiq ROC tahlili asosida AUCni baholash bilan tavsiflangan.Optimal ehtimollik chegarasi modelning maksimal Youden indeksi (sezuvchanlik + o'ziga xoslik - 1) asosida olingan.Qiymatlari chegaradan kichik yoki katta bo'lgan namunalar mos ravishda benign tugunlar va o'pka adenokarsinomasi sifatida taxmin qilinadi.
A549 hujayralari (#CCL-185, American Type Culture Collection) 10% FBS o'z ichiga olgan F-12K muhitida o'stirildi.SLC7A5 ga qaratilgan qisqa soch turmagi RNK (shRNK) ketma-ketligi va maqsadsiz boshqaruv (NC) lentiviral vektor pLKO.1-puro ichiga kiritildi.shSLC7A5 ning antisens ketma-ketliklari quyidagicha: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').SLC7A5 (# 5347) va tubulin (# 2148) ga antikorlar Cell Signaling Technology'dan sotib olindi.Western blot tahlili uchun SLC7A5 va tubulinga antikorlar 1:1000 suyultirishda ishlatilgan.
Seahorse XF glikolitik stress testi hujayradan tashqari kislotalanish (ECAR) darajasini o'lchaydi.Tahlilda glyukoza, oligomisin A va 2-DG ECAR tomonidan o'lchangan hujayraning glikolitik qobiliyatini sinash uchun ketma-ket kiritildi.
Maqsadli bo'lmagan nazorat (NC) va shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bilan transfektsiyalangan A549 hujayralari bir kechada 10 sm diametrli idishlarda qoplangan.Hujayra metabolitlari 1 ml muzli 80% suvli metanol bilan ekstraksiya qilindi.Metanol eritmasidagi hujayralar qirib tashlandi, yangi kolba ichiga yig'ildi va 4 ° C da 15 daqiqa davomida 15000 × g da santrifüj qilindi.800 µl supernatant yig‘ing va yuqori tezlikda ishlaydigan vakuumli kontsentrator yordamida quriting.Keyin quritilgan metabolit granulalari yuqorida tavsiflanganidek LC-MS/MS yordamida triptofan darajalariga tahlil qilindi.A549 hujayralarida (NC va shSLC7A5) uyali NAD(H) darajalari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq miqdoriy NAD+/NADH kolorimetrik to'plami (#K337, BioVision) yordamida o'lchandi.Metabolitlar miqdorini normallashtirish uchun har bir namuna uchun protein darajasi o'lchandi.
Namuna hajmini oldindan aniqlash uchun statistik usullar qo'llanilmadi.Biomarkerni topishga qaratilgan oldingi metabolomik tadqiqotlar 15,18 o'lchamni aniqlash uchun mezon sifatida ko'rib chiqilgan va bu hisobotlar bilan solishtirganda bizning namunamiz etarli edi.Tadqiqot kogortasidan hech qanday namunalar chiqarib tashlanmadi.Maqsadsiz metabolomik tadqiqotlar uchun sarum namunalari tasodifiy ravishda kashfiyot guruhiga (306 holat, 74,6%) va ichki tekshirish guruhiga (104 holat, 25,4%) tayinlangan.Biz, shuningdek, maqsadli metabolomik tadqiqotlar uchun topilgan kashfiyotdan har bir guruhdan 70 ta holatni tasodifiy tanladik.Tergovchilar LC-MS ma'lumotlarini yig'ish va tahlil qilish paytida guruh topshirig'iga ko'r bo'ldi.Metabolomik ma'lumotlarning statistik tahlillari va hujayra tajribalari tegishli Natijalar, Rasm afsonalari va Usullar bo'limlarida tasvirlangan.Uyali triptofan, NADT va glikolitik faollikni miqdoriy aniqlash bir xil natijalar bilan uch marta mustaqil ravishda amalga oshirildi.
Tadqiqot dizayni haqida ko'proq ma'lumot olish uchun ushbu maqola bilan bog'liq bo'lgan Tabiiy portfel hisobotining qisqacha mazmuniga qarang.
Chiqarilgan xususiyatlarning xom MS ma'lumotlari va mos yozuvlar sarumining normallashtirilgan MS ma'lumotlari mos ravishda 1-qo'shimcha ma'lumotlar va 2-qo'shimcha ma'lumotlarda ko'rsatilgan.Differensial xususiyatlar uchun eng yuqori izohlar Qo'shimcha ma'lumotlar 3da keltirilgan. LUAD TCGA ma'lumotlar to'plamini https://portal.gdc.cancer.gov/ saytidan yuklab olish mumkin.Grafikni tuzish uchun kirish ma'lumotlari manba ma'lumotlarida keltirilgan.Ushbu maqola uchun manba ma'lumotlari keltirilgan.
Milliy o'pka skrining tadqiqot guruhi va boshqalar. Past dozali kompyuter tomografiyasi yordamida o'pka saratoni o'limini kamaytirish.Shimoliy Angliya.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR va Payg'ambar, PC Past dozali spiral KT yordamida o'pka saratoni skriningi: Milliy o'pka skrining tadqiqoti (NLST) natijalari.J. Med.Ekran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ va boshqalar.Randomize sinovda volumetrik KT skrining yordamida o'pka saratoni o'limini kamaytirish.Shimoliy Angliya.J. Med.382, 503–513 (2020).
Yuborilgan vaqt: 2023 yil 18-sentabr